Principios fsicos de la electroforesis en gel de agarosa

La electroforesis en gel es una tcnica que se emplea para separar los cidos nucleicos y las protenas. La separacin de las macromolculas depende de dos variables: carga y masa. Cuando una muestra biolgica, como por ejemplo el ADN, se mezcla en una solucin tampn y se aplica a un gel, esas dos variables actan conjuntamente. La corriente elctrica de un electrodo repele las molculas, al tiempo que el otro electrodo las atrae. La fuerza de friccin del material de gel acta como tamiz molecular, separando las molculas en funcin de su tamao. Durante la electroforesis, las macromolculas son empujadas a travs de los poros, dependiendo su tasa de migracin por el campo elctrico de los siguientes factores: fuerza del campo tamao y forma de las molculas hidrofobicidad relativa de las muestras fuerza inica y temperatura del tampn en que se desplazan las molculas.

Componentes de la electroforesis en gel de agarosa

Agarosa
La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacrido lineal (con un peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repeticin de la unidad bsica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6anhidrogalactosa. La agarosa es muy frgil y las manipulaciones pueden destruirla con facilidad. Los geles de agarosa poseen grandes poros y se emplean fundamentalmente para separar las molculas grandes con un peso molecular de ms de 200 kDa. Los geles de agarosa permiten una electroforesis rpida, pero con una resolucin limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse. Ello obedece al tamao de los poros y no puede controlarse. Los geles de agarosa se obtienen por suspensin de agarosa seca en polvo en un tampn acuoso, tras lo cual se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa se funde y se convierte en una solucin transparente. A continuacin, se vierte esta solucin en un molde para gel y se deja enfriar a temperatura ambiente hasta que se forma un gel rgido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene determinada por su concentracin.

Tampn de electroforesis
La movilidad electrofortica del ADN se ve afectada por la composicin y la fuerza inica del tampn de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia elctrica es mnima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampn de elevada fuerza inica la conductancia elctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se desnaturaliza. Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentracin de aproximadamente 50 mM (pH 7,5 7,8). Los tampones de electroforesis suelen prepararse en forma de soluciones concentradas y se conservan a temperatura ambiente. El TBE se utilizaba inicialmente a una concentracin de trabajo de 1x en el caso de la electroforesis en gel de agarosa. No

obstante, una solucin de trabajo de 0,5x proporciona un poder ms que suficiente y en la actualidad prcticamente todas las electroforesis en gel de agarosa se practican utilizando esta concentracin.

Concentracin de agarosa
Un fragmento de ADN de un tamao determinado migra a diferentes velocidades a travs de los geles segn la concentracin de agarosa. En funcin de la concentracin de agarosa o tampn, se pueden separar segmentos de ADN que contengan de 20 a 50 000 pb. En los geles horizontales, la agarosa se emplea por lo general en concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 % (

ADN marcador
Para una tensin, un gel de agarosa y unas concentraciones de tampn determinadas, la distancia de migracin depende del peso molecular del material inicial. As pues, debe cargarse un ADN marcador de tamao conocido en las ranuras situadas en los extremos derecho e izquierdo del gel. Generalmente un marcador contiene un nmero determinado de segmentos de ADN conocidos, lo cual facilita la labor de determinar el tamao de los ADN desconocidos en caso de que se produjese alguna distorsin sistemtica del gel durante la electroforesis. Pagina 78

Tampn de carga
Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan en primer lugar con un tampn de carga que por lo general contiene agua, sacarosa y un colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de bromocresol, etc.). La cantidad mxima de ADN que puede cargarse depende del nmero de fragmentos. La cantidad mnima de ADN que puede detectarse mediante fotografa de los geles teidos con bromuro de etidio es de aproximadamente 2 ng en una banda de 0,5 cm de ancho. Si una banda de este ancho contiene ms de 500 ng de ADN, la ranura estar sobrecargada y se producir emborronamiento. El tampn de carga se emplea con tres fines: aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan uniformemente en el pocillo aadir color a la muestra, simplificando de este modo el proceso de carga incorporar un colorante a la muestra que, en un campo elctrico, se desplace hacia el nodo a una velocidad previsible.