Práctica 18.

Marcadores moleculares
en mejora genética

Dra. Silvia Hildebrandt

Mejora genética animal
Facultad de Veterinaria
Universidad de Las Palmas de Gran Canaria
Curso 2022-2023
MICROSATÉLITES
• ¿Qué son?
• ¿Para qué sirven?
• ¿Cómo se heredan?
• Algunas aplicaciones
• Ejemplos de asignación parental
• Probabilidad de exclusión a priori (PE)
• Probabilidad de exclusión combinada (PEC)
• ¿Cómo se detectan?
• Extracción de ADN
• Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Electroforesis
• Ejemplo de detección de microsatélites
• Ventajas
• Ejercicios de lectura de microsatélites (PbMS2, SaGT31 y SaGT41b)
• PCR múltiple
 MICROSATÉLITES

¿Qué son?
Son regiones del ADN en las que un fragmento (de uno hasta seis nucleótidos) se repite
de manera consecutiva. Generalmente se encuentran en zonas no codificantes y poseen
una alta tasa de mutación, lo que los hace muy polimórficos.

7 repeticiones de 2 nucleótidos
ATGCTTATCACACACACACACATTAT
||||||||||||||||||||||||||
TACGAATAGTGTGTGTGTGTGTAATA

3 repeticiones de 3 nucleótidos
GATTCACAACAACAATCGATAG
||||||||||||||||||||||
CTAAGTGTTGTTGTTAGCTATC
MICROSATÉLITES

¿Para qué sirven?

Son utilizados como marcadores moleculares que sirven para “marcar” la
posición de un gen en concreto o la herencia de una característica particular.
En un cruzamiento genético, las características de interés seguirán
generalmente unidas a los marcadores moleculares. Por lo tanto, se pueden
seleccionar individuos en los que el marcador molecular esté presente, ya que
el marcador indica la presencia de la característica deseada.
La utilidad del microsatélite consiste en las veces en que se produce la
repetición y que puede variar entre individuos, entre poblaciones o entre
especies, lo que permite identificarlos.
Para que un microsatélite sea considerado útil como marcador molecular, toda
la variación de la secuencia o polimorfismo debe hallarse dentro del patrón
repetitivo, y por el contrario, las regiones flanqueantes deben estar altamente
conservadas al punto de no presentar ninguna variación de secuencia.
EJEMPLO:
Individuo / población A: ATGCTTATCACACACACACACATTAT (CA)7
Individuo / población B: ATGCTTATCACACACACACACACACATTAT (CA)9
MICROSATÉLITES
Algunas aplicaciones
• Identificación individual

• Control de parentesco

• Genealogías

• Programas de mejora genética

• Estructura genética de poblaciones

• Estudios de diversidad genética basada en distancia

genética

• Estimas de flujo genético

• Estimas de consanguinidad

• Diagnóstico de enfermedades
MICROSATÉLITES
¿Cómo se heredan?
• Por herencia mendeliana simple, en codominancia
ASIGNACIÓN PARENTAL:
(conociendo el sexo de los reproductores)
ASIGNACIÓN PARENTAL:
(sin conocer el sexo de los reproductores)

?
MICROSATÉLITES

Probabilidad de exclusión a priori (PE)

Es una medida de la utilidad o bondad de un marcador microsatélite para excluir a un

posible candidato de una asignación parental.
Este valor depende de:
1. El polimorfismo: la PE es mayor cuantos más alelos tenga un marcador
2. Las frecuencias alélicas o distribución de los alelos en una determinada población:
la PE es mayor cuanto más homogéneamente distribuidos estén los alelos.

(Jamieson, 1994 Animal Genetics vol. 25:37-44)

Siendo n el número de alelos y pi la frecuencia de cada alelo

 MICROSATÉLITES

Probabilidad de exclusión combinada (PEC)

Es la combinación de las probabilidades de exclusión de una batería de marcadores

microsatélite utilizados en un estudio de asignación parental.

Siendo k el número de marcadores microsatélite, y P el valor independiente de probabilidad de exclusión a priori de

cada uno de ellos
MICROSATÉLITES

¿Cómo se detectan?

1. Extracción del ADN a partir de una muestra de tejido

EXTRACCIÓN DE ADN
EXTRACCIÓN DE ADN
MICROSATÉLITES

¿Cómo se detectan?

1. Extracción del ADN a partir de una muestra de tejido

2. Amplificación del marcador microsatélite mediante la técnica de la PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction)

¿Qué es?

Es una técnica que permite amplificar una o pocas copias de un determinado

fragmento de ADN en varios órdenes de magnitud, generando millones de
copias.
Se basa en cambios de temperatura cíclicos de calentamiento y enfriamiento
para la desnaturalización de las hebras de ADN originales y su amplificación
utilizando una enzima termoestable (Taq polimerasa). A medida que avanzan
los ciclos de cambio de temperatura, las nuevas copias de ADN generadas
actúan como molde produciéndose una reacción en cadena en la que el ADN
se amplifica de forma exponencial.

Muestra de ADN Región de interés ADN amplificado

PCR (Polymerase Chain Reaction)
 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Componentes de la PCR
1. ADN molde (template): aquel fragmento de ADN del cual
se quieren generar las copias
2. Cebadores (primers): cortos fragmentos de ADN que
flanquean la región que se desea amplificar
(microsatélite). Son zonas del ADN muy conservadas.
3. Nucleótidos (dNTP): componentes de la cadena de ADN
4. Enzima Taq polimerasa (Taq): enzima termoestable que Taq
actúa uniendo nucleótidos complementarios a una hebra FWD primer
de ADN generando así una hebra complementaria. No es
capaz de iniciar la síntesis de ADN a partir de nucleótidos REV primer
libres por lo que necesariamente requiere de un cebador.

G
5. Tampón (buffer): mantiene el pH óptimo para que actúe G
T
la enzima C G A

T
G

C
C TA

A
A C G A
A G T

G
A T C C
6. Sales (MgCl2): proporcionan la fuerza iónica adecuada G

C
para una máxima actividad de la enzima. Su
concentración influye en la Tm (temperatura de fusión) y
en la Th (temperatura de hibridación).
7. Agua milli-Q
 PCR (Polymerase Chain Reaction)

1 94ºC La doble hélice de ADN se separa

en 2 hebras sencillas
Desnaturalización

Los cebadores se unen a los

lugares complementarios de cada
hebra de ADN. La temperatura es
2 Tm (50- Primer 1
específica de cada juego de
60ºC) cebadores.
Hibridación Primer 2

La Taq incorpora los nucleótidos a

cada hebra de ADN generando un
3 nuevo fragmento de ADN que será
72ºC
una copia exacta del ADN molde.
Taq DNA
polymerase dNTPs
Extensión
LOS 3 PASOS FORMAN
UN CICLO QUE SE
REPITE 30 VECES
 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Amplificación exponencial En cada ciclo la cantidad de producto de PCR se duplica

…hasta que se
…la cantidad de agotan los
producto de PCR se reactivos y la
incrementa cada vez reacción se para.
más rápido…

Al principio de la
reacción hay pocas
copias de la región de
interés y la cantidad
de producto crece
lentamente…
Endpoint PCR vs qPCR
La Endpoint PCR observa el producto de
PCR cuando se ha alcanzado la fase de
meseta

La qPCR permite observar el producto de PCR

durante la fase exponencial, cuando se está
duplicando en cada ciclo
 Endpoint PCR vs qPCR

En la qPCR se usa un Fluorescent dye

fluorocromo que fluorece
cuando está unido a una
cadena doble de ADN
(dsDNA).

En cada ciclo de PCR se

produce más dsDNA y la
fluorescencia es cada vez
mayor.
Endpoint PCR vs qPCR

Fluorescencia

Ct

Muestra Ct Diferencia respecto al patrón Concentración

Verde 14 -6 26*100 ng/µl = 6400 ng/µl
Gris 16 -4 24*100 ng/µl = 1600 ng/µl
Azul (patrón) 20 --- 100 ng/µl
Amarilla 27 +7 2-7*100 ng/µl = 0,78 ng/µl
PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR (Polymerase Chain Reaction)
MICROSATÉLITES

¿Cómo se detectan?

1. Extracción del ADN a partir de una muestra de tejido

2. Amplificación del marcador microsatélite mediante la técnica de la PCR

3. Separación de los alelos de cada marcador microsatélite en función de su

tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
ELECTROFORESIS

¿Qué es?

1. Método capaz de separar macromoléculas en función de sus principales

características (tamaño, forma, carga eléctrica…).

2. Las moléculas migran a través de un entramado (gel de agarosa /

poliacrilamida) al aplicarse un campo eléctrico entre dos electrodos
inmersos en una solución tampón.

3. Las moléculas que por sus características oponen mayor resistencia a la

migración, lo harán a menor velocidad. Así las moléculas de mayor tamaño
tardarán más en migrar y quedarán más rezagadas. La velocidad de
migración es inversamente proporcional al tamaño de la molécula.

4. El ADN es una molécula de carga negativa por lo que migrará del electrodo
negativo al electrodo positivo.
ELECTROFORESIS

Pocillos

Pocillos Pocillos
ELECTROFORESIS
ELECROFORESIS

Funcionamiento
MICROSATÉLITES

Ventajas de los microsatélites como marcadores moleculares

1. Poseen una alta tasa de mutación, lo que los hace muy polimórficos. Los
alelos se distinguen fácilmente por el número de repeticiones del patrón.
2. Son codominantes por lo que en la herencia ambos alelos procedentes de
los padres dominan por igual y se manifiestan a la vez permitiendo distinguir
homocigotos de heterocigotos.
3. Son específicos de un locus por lo que se pueden usar primers específicos
para amplificarlos.
4. Son fácilmente detectables mediante una técnica automatizada y de alta
reproducibilidad como es la PCR. Es una técnica barata y sólo son
necesarias cantidades muy pequeñas de ADN.
5. Están ampliamente distribuidos por todo el genoma. Se estima que en el
genoma de peces aparece 1 microsatélite cada 10Kbp.
6. Tienen múltiples aplicaciones.
EJEMPLO

222 pb 222 pb 228 pb 230 pb 214 pb

214 pb 230 pb 214 pb 222 pb 214 pb

302 pb 300 pb 310 pb 310 pb 300 pb

310 pb 302 pb 320 pb 310 pb 320 pb

 EJEMPLO

222 pb 302 pb 222 pb 300 pb 228 pb 310 pb 230 pb 310 pb 214 pb 300 pb

214 pb 310 pb 230 pb 302 pb 214 pb 320 pb 222 pb 310 pb 214 pb 320 pb

320 pb

310 pb

302 pb
300 pb

230 pb
228 pb

222 pb

214 pb
MICROSATÉLITES electroforesis en gel de poliacrilamida
MICROSATÉLITES electroforesis en gel de poliacrilamida
MICROSATÉLITES electroforesis en gel de poliacrilamida
PbMS2
SaGT31
MICROSATÉLITES secuenciador automático
MICROSATÉLITES secuenciador automático

fluorescencia LÁSER
MICROSATÉLITES secuenciador automático

fluore
fluore s
scenccencia
fluorescencia ia
LÁSER
fluorescencia a
o r e s c e nc i
flu
MICROSATÉLITES secuenciador automático

Ejemplo de homocigotos y heterocigotos

MICROSATÉLITES secuenciador automático

Ejemplo de reflejo
MICROSATÉLITES secuenciador automático

Ejemplo de descendencia

MADRE

HIJO

MADRE

HIJO

MADRE

HIJO
descendiente

reproductor1

reproductor2

reproductor3

reproductor4
descendiente

reproductor1

reproductor2

reproductor3

reproductor4
descendiente

reproductor1

reproductor2

reproductor3

reproductor4
descendiente

reproductor1

reproductor2

reproductor3

reproductor4
descendiente

reproductor1

reproductor3

reproductor4
descendiente

reproductor3

reproductor4
descendiente

reproductor3

reproductor4
 MICROSATÉLITES secuenciador automático

¿Qué componente tiene el fluorocromo?

1. ADN molde (template)

ATGGGCCAA
ATGCTTATCACACACACACACATTATACCCGGTT
2. Cebadores (primers)
||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAATAGTGTGTGTGTGTGTAATATGGGCCAA
3. Nucleótidos (dNTP)
ATGCTTAT
4. Enzima Taq polimerasa (Taq)

5. Tampón (buffer) A C G T

6. Sales (MgCl2)

7. Agua milli-Q
PCR MÚLTIPLE
¿QUÉ ES?
Amplificar en una sola reacción de PCR distintas zonas del mismo
ADN molde simultáneamente.

ZONA 1 ZONA 2 ZONA 3

PCR MÚLTIPLE

Ciclo de temperatura:

94ºC

Tm ?

72ºC
 PCR MÚLTIPLE

Para resolver este problema se han desarrollado diferentes tipos

de PCRs múltiples.
 PCR MÚLTIPLE
ATGGGCCAA
1. Buscamos marcadores con igual Tm ATGCTTATCACACACACACACATTATACCCGGTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAATAGTGTGTGTGTGTGTAATATGGGCCAA
ATGGGCCAA ATGCTTAT
ATGCTTATCACACACACACACATTATACCCGGTT
|||||||||||||||||||||||||||||||||| 55ºC
TACGAATAGTGTGTGTGTGTGTAATATGGGCCAA
ATGCTTAT
55ºC ATGCTTAT
ATGCTTATCACACACACACACATTATACCCGGTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAATAGTGTGTGTGTGTGTAATATGGGCCAA
ATGGGCCAA

52ºC
ATGCTTAT
ATGCTTATCACACACACACACATTATACCCGGTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAATAGTGTGTGTGTGTGTAATATGGGCCAA
ATGGGCCAA

ATGCTTAT
54ºC ATGCTTATCACACACACACACATTATACCCGGTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAATAGTGTGTGTGTGTGTAATATGGGCCAA
ATGGGCCAA

55ºC
 PCR MÚLTIPLE

1. Buscamos marcadores con igual Tm

2. PCR múltiple por “touchdown”

1. 94ºC

2.a 52ºC
2.b 53ºC
2.c 54ºC

3. 72ºC
 PCR MÚLTIPLE
1. Buscamos marcadores con igual Tm
2. PCR múltiple por “touchdown”
3. Rediseñando los primers de los marcadores para que
tengan la misma Tm
AATATGG
ATGCTTATCACACACACACACATTATACCCGGTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAATAGTGTGTGTGTGTGTAATATGGGCCAA
ATGCT
54ºC
TGGGCAA
ATGCTTATCACACACACACACATTATACCCGGTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAATAGTGTGTGTGTGTGTAATATGGGCCAA
ATGCTT
55ºC
GAATA
ATGCTTATCACACACACACACATTATACCCGGTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAATAGTGTGTGTGTGTGTAATATGGGCCAA
CCGGTT
52ºC
 PCR MÚLTIPLE
1. Buscamos marcadores con igual Tm
2. PCR múltiple por “touchdown”
3. Rediseñando los primers de los marcadores para que
tengan la misma Tm
TGGGCCAA
ATGCTTATCACACACACACACATTATACCCGGTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAATAGTGTGTGTGTGTGTAATATGGGCCAA
ATGCTTAT
60ºC
AATATG
ATGCTTATCACACACACACACATTATACCCGGTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAATAGTGTGTGTGTGTGTAATATGGGCCAA
CTTAT
60ºC
TACGAA
ATGCTTATCACACACACACACATTATACCCGGTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAATAGTGTGTGTGTGTGTAATATGGGCCAA
TATACCC
60ºC
 PCR MÚLTIPLE

¿Cómo se optimiza una PCR múltiple? Es decir, ¿Cómo logramos que

todos los marcadores moleculares amplifiquen con la misma
intensidad o rendimiento?

- En una PCR simple se amplifica cada marcador por separado y se

cargan en la misma carrera en el secuenciador automático, para que
todos los picos salgan igual, cargas más volumen de los más flojos y
al revés.

- En una PCR múltiple debes optimizarlo en la misma reacción, y la

única manera es cambiando las concentraciones de cada pareja de
primers.
 PCR MÚLTIPLE
Rangos alélicos Genotipo individuo
Microsatélite A: 60 – 130 pb Microsatélite A: 80 / ?
Microsatélite B: 100 – 200 pb Microsatélite B: ? / 145

Micro A Micro A ó B Micro A ó B Micro B

Rangos alélicos Genotipo individuo

Microsatélite A: 60 – 130 pb Microsatélite A: 80 / 120
Microsatélite B: 100 – 200 pb Microsatélite B: 105 / 145
 PCR MÚLTIPLE
Rangos alélicos Genotipo individuo
Microsatélite A: 60 – 110 pb Microsatélite A: 80 / 105
Microsatélite B: 115 – 160 pb Microsatélite B: 120 / 145
PCR MÚLTIPLE

VENTAJAS
con respecto a la simple

• MÁS ECONÓMICA

• MÁS RÁPIDA

• MENOS ERRORES
PCR MÚLTIPLE

DISEÑA TU PROPIA
MÚLTIPLEX
Amplificación inadecuada
Lee-Montero et al. (2013) rediseñaron un total de 138 microsatélites
descritos en dorada (Sparus auratus), que amplifican todos en las
mismas condiciones de PCR. Los amplificaron primero mediante
PCR simple y evaluaron su facilidad de lectura y variabilidad
genética. Rechazaron todos aquellos
Desaparición quepesado
del alelo no amplificaron, los que
tenían algún error de lectura y los que tenían poca variabilidad
genética, quedando un total de 79 microsatélites óptimos.
A partir de estos 79 microsatélites diseñaron dos supermúltiplex,
llamadas SMsa1 y SMsa2,Patróncon el número
de bandas no clarasmáximo de marcadores
teniendo en cuenta que no se solaparan los rangos alélicos. Para
ello los separaron dentro de cada color un total de 18 pares de
bases.
  Alelos intermedios
PCR MÚLTIPLE

DISEÑA TU PROPIA
MÚLTIPLEX
A partir de microsatélites de
dorada polimórficos y de alta
facilidad de lectura, que
amplifican todos a la misma
temperatura (Tm=60ºC)
(Lee-Montero et al., 2013)
 63 pb 205 pb

F3-LG14-TAGA-9-0,923-0,887-0,863

79
MARCADORES
MICROSATÉLITES
ÓPTIMOS

ORDENADOS POR SU Nombre

RANGO ALÉLICO Grupo de ligamiento
Motivo de repetición
Número de alelos
Heterocigosidad observada
Heterocigosidad esperada
Probabilidad de exclusión