ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Y OTRAS ENZIMAS
UTILIZADAS EN
INGENIERÍA GENÉTICA
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Importancia en el desarrollo de la ingeniería
genética
EcoRI GAATTC
CTTAAG
Restricción-modificación

m
Metilasa G-A-A-T-T-C
EcoRI C-T-T-A-A-G G-A-A-T-T-C
m C-T-T-A-A-G
m Nucleasa
G-A-A-T-T-C EcoRI
C-T-T-A-A-G G-A-A-T-T-C
m C-T-T-A-A-G
Nucleasa
EcoRI
m G A-A-T-T-C
G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A G
C-T-T-A-A-G
m
Sistemas de modificación- restricción:
mecanismo de defensa de las bacterias
contra DNA invasor

Par
endonucleasa + metilasa

misma especificidad
(reconocen la misma
secuencia)
Tipos de enzimas de restricción

Tipo IIs: Reconocen secuencias no palindrómicas, 4-7 pb. Sitio de

corte en la secuencia y hasta 20 pb de distancia
 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

- Desoxirribonucleasas, con actividad endonucleolítica, que

reconocen secuncias específicas en el DNA
- Estas secuencias tienen a menudo estructura palindrómica
(simetría), y una longitud de 4, 6, 8 nucleótidos

GTAC GTCGAC GTCCGGAC

CATG CAGCTG CAGGCCTG

44 46 48

256 4096 65536

Sitios de corte de las endonucleasas de
restricción del tipo II

Tipo IIs: MboII

Extremos protuberantes o cohesivos
5’ protuberantes

EcoRI G-3’
CTTAA-5’
GAATTC
CTTAAG
5’-AATTC
3’-G
Extremos protuberantes o cohesivos
3’ protuberantes

PstI CTGCA-3’
G-5’
CTGCAG
GACGTC
5’-G
3’-ACGTC
 Extremos romos

SmaI CCC-3’
GGG-5’
CCCGGG
GGGCCC
5’-GGG
3’-CCC
 Extremos compatibles (I)

EcoRI
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
EcoRI CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
 Extremos compatibles (II)

SalI
GTCGAC
CAGCTG
GTCGAG
XhoI CAGCTC
CTCGAG
GAGCTC
 Extremos romos
(siempre compatibles)

SmaI
CCCGGG
GGGCCC
CCCATC
EcoRV GGGTAG
GATATC
CTATAG
Extremos 5’ protuberantes no compatibles.
Rellenados, se transforman en romos
(siempre compatibles)
EcoRI
GAATTC G-3’
AATT-3’
CTTAAG CTTAA-5’
XhoI Klenow + dNTPs GAATT TCGAG
CTTAA AGCTC
CTCGAG 5’-TCGAG
GAGCTC GC T
3’-A3’-C
Extremos 3’ protuberantes no compatibles.
Degradado de cadena sencilla para
convertirlos en extremos romos
PstI
CTGCAG -3’
-3’
-3’
-3’
CTGCA-3’
GACGTC G-5’

• Nucleasa S1: endonucleasa específica de cadena sencilla

• Mung Bean: endonucleasa específica de cadena sencilla
• T4 DNA polimerasa: Carece de la actividad exonucleasa 5’→3’, pero retiene la
actividad exonucleasa 3’→5’
• Klenow: Carece de la actividad exonucleasa 5’→3’, pero retiene la actividad
exonucleasa 3’→5’
La metilación del ADN en eucariotas superiores está relacionada con la
regulación de la transcripción. El uso de algunas enzimas de restricción
específicas permite distinguir entre ADN metilado y no metilado,
obteniéndose de esta manera información sobre la posible regulación
de la expresión de un gen por metilación del ADN

Vertebrados: metilación de la C en secuencias CG en el C5, generando 5-

metilcitosina: m5CG. Secuencias (islas) CpG, implicadas en regulación de la
transcripción.
HpaII, MspI: isosquizómeros, reconocen C/CGG

Plantas: metilación m5CG y m5CNG.

Uso de endonucleasas con diferente sensibilidad a metilación:
McClelland M. 1983. The frequency and distribution of methylatable DNA
sequences in leguminous plant protein coding genes. J. Mol. Biol. 19: 346-354
 Aspectos prácticos

Unidad: Cantidad de enzima que digiere 1 mg de ADN en 1 hora a la

temperatura y condiciones óptimas.

Inhibición: Adición de 20 mM EDTA

Inactivación: Por calor o tratamiento con fenol-CIA

Dos enzimas de restricción pueden utilizarse simultáneamente siempre

que compartan las mismas condiciones de digestión (temperatura, pH,
concentración de sales)
POLIMERASAS Y ENZIMAS
MODIFICADORAS DEL ADN
DNA polimerasas: actividades y propiedades
DNA polimerasas: actividades y propiedades

5’ 3’OH
DNA molde con primer
3’ 5’

dsDNA con huecos

Extremos 5’ protuberantes

3’OH 5’P 3’OH 5’P

dsDNA con “nicks” (nick translation)

5’ Hairpin
3’OH
Nick Translation
DNasa I

DNA polimerasa I
DNA polimerasas: utilidades

DNA Polimerasa I
- Marcaje por “nick translation”

Klenow
- Rellenado de extremos 5’ protuberantes
- Síntesis de la segunda hebra de cDNA

T4 polimerasa
- Eliminación de extremos 3’ protuberantes

Taq DNA polimerasa (Vent, Pfu)

- PCR

Transcriptasa reversa (AMV: avian myeloblastosis virus) (MMLV: Moloney murine

leukemia virus) (Tth: Thermus thermophylus)
- Síntesis de cDNA a partir de RNA
 Enzimas modificadoras: actividades y utilidades

DNA ligasa (del bacteriófago T4)

- Forma enlaces fosfodiester entre un extremo 5’ P y otro 3’OH. Requiere ATP
- Usos: Unir dos moléculas de DNA: vector - inserto

3’OH 5’P 3’OH 5’P Ligasa

NNG GATCCNN NNGGATCCNN
NNCCTAG GNN NNCCTAGGNN
Ligasa
NNGGA TCCNN NNGGATCCNN
3’OH 5’P NNCCT AGGNN NNCCTAGGNN
5’P 3’OH

Fosfatasa alcalina (BAP: bacterial alcaline phosphatase) (CIP: calf intestinal

alkaline phosphatase) (SAP: shrimp alkaline phosphatase)
- Eliminan el grupo fosfato del extremo 5’ de DNA, RNA y dNTPs
- Usos: desfosforilación de extremos en experimentos de ligación vector-
inserto
Acción de la DNA ligasa
Enzimas modificadoras: actividades y utilidades
Fosfatasa alcalina
Enzimas modificadoras: actividades y utilidades

Polinucleótido kinasa
- Transfiere el grupo fosfato g desde una molécula de ATP a un extremo 5’ de DNA o
RNA
- Usos: Marcaje 5’ terminal de una molécula de DNA
Fosforilación de fragmentos de DNA que carecen de P en 5’ para ligación

Nucleasas
Ribonucleasa H (RNasa H)
- Degradación endonucleolítica del RNA en híbridos DNA-RNA

DNasa I (de páncreas bovino)

- Corta ambas hebras del DNA en presencia de Mn2+. En presencia de Mg2+
corta una sóla hebra (nick)
- Usos: Eliminación de DNA en muestras de RNA (Mn2+)
DNA footprinting (Mn2+)
Nick translation: generación de nicks para acción de DNA pol. I (Mg2+)