Secuenciación

➔ Consiste en averiguar, a partir de un ADN molde de secuencia parcialmente

desconocida (como en el caso de una mutación nueva que no se halla investigado),
dicha secuencia para analizar si hay daños en el genoma.
➔ Fundamento: Construir una cadena complementaria mediante una ADN polimerasa,
utilizando Dideoxis.

Síntesis de nueva hebra por parte de las ADN Pol:

Las ADN Pol, no polimerizan de novo, sino que extienden hebras preexistentes; eso significa que el ultimo
nucleótido que fue adicionado a una hebra en crecimiento, posee en su extremo 3’, un grupo hidroxilo libre. Este
hidroxilo libre es muy importante, ya que sirve para que se forme el enlace fosfodiéster, para unir otra secuencia
(que se forme el enlace covalente).

Método de secuenciación de Sanger (Método de los Dideoxis)

→ Sirve para determinar la secuencia de bases de un fragmento de ADN desconocido.
(secuencia del genoma humano).
→ Esta técnica es altamente fiel.
→ Es muy costosa.
→ Se sigue utilizando hoy en día, pero ya no para secuenciar genomas completos, sino en el
contexto clínico, un gen en particular.
Fundamentos:
o Utiliza fragmentos de ADN amplificados
o Utiliza como herramienta molecular, una variante de los desoxirribonucleótidos
trifosfato, que es una variante que carece del grupo hidroxilo en el extremo 3’ (OH).
o A estas variantes, se los conoce como dideoxirribonucleotidos trifosfato (Dideoxis).
o Estos dideoxis entonces, una vez que se incorporan a la cadena de ADN, finalizan la
polimerización. Y así, marcan las posiciones de bases específicas.
→ Para poder amplificar el ADN, podemos utilizar la técnica de PCR, pero primero, debemos
adicionarle dos cadenas de ADN conocidas en sus extremos. Para eso, debemos generar
primers, para que comience la polimerización.
→ También, incorporamos a los Dideoxis (todas las clases: ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP).
→ Estos dideoxis, están marcados con fluoróforos distintos.
→ Al final de la síntesis, vamos a tener una mezcla compleja de productos. Muchos de esos
productos, van a tener una síntesis completa (los que no incorporaron a los dideoxis), y
 también vamos a tener fragmentos que no terminaron su polimerización, y que quedaron
detenidos en distintos puntos de la síntesis.
→ Cada fragmento va a ser distinto en longitud, y van a estar asociados a un fluoróforo distinto.
→ Debido a esto, podemos someterlas a electroforesis (debido a su distinto tamaño). Y, además,
cada banda, va a emitir una fluorescencia distinta.
→ En función de la fluorescencia, se podría reconstruir la secuencia de bases que tiene la cadena
que se polimerizó.
➔ La cadena que se origina, es la cadena complementaria a la cadena molde que
colocamos al principio. Solo basta con leerla al revés (su complementariedad) y
obtendremos la secuencia desconocida.
 Método de Secuenciación de Alto Rendimiento (High-
Throughput)
→ Permite secuenciar millones de fragmentos de moléculas distintas en paralelo. (de manera
simultánea).
→ Esto no lo podía hacer el Método de Sanger.
→ En este método, se necesita de un genoma humano de referencia.
→ Es mucho menos costosa.
Pasos:
1. Extracción y Fragmentación del ADN
2. Preparación de la muestra (amplificación por PCR y unión de moléculas adaptadoras)
3. Secuenciación de los fragmentos.
4. Análisis bioinformático.

PCR Alelo Especifica

→ Se usa para detectar mutaciones, variantes genéticas, de tipo missenses o sinónimas.
→ Busca amplificar la zona que presente la mutación mediante primers que se pegan con
la secuencia mutada, para luego pegarle una sonda y ver si se detectan las bandas en el
revelado.
Se usan 3 primers:
o Primer Reverse, con secuencia Wild type. (los “normales”)
o Primer Forward, con secuencia Wild Type.
o Primer con la variante genética/mutación que quiero evidenciar si el paciente lo
tiene o no. Es decir, un primer complementario con la mutación que buscamos.
➔ Entonces repetimos los mismos pasos que en la PCR, y vamos a observar que, si existe la
mutación, el primer mutado se va a poder pegar, y por ende se van a sintetizar las copias
(cadena de arriba). Si no existe esa mutación, no se sintetizarán las copias. ya que el primer
mutado no puede hibridar (cadena de abajo).
➔ El producto obtenido será luego estudiado con la técnica de Electroforesis, la cual nos
permitirá conocer si efectivamente hay o no mutación.
PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
o Comienza con una PCR, en la cual voy a amplificar una secuencia. En esa secuencia que
amplifique, dentro de ella, va a estar la secuencia que a mí me interesa.
o Requiere la combinación de Enzimas de Restricción (ER)
➔ Son endonucleasas, que reconocen secuencias específicas.
➔ Son de origen Bacteriano.
➔ Tienen capacidad de reconocimiento secuencia especifica ALTA, ya que reconocen
hasta un cambio de un solo nucleótido.
➔ Cuando encuentran la secuencia de interés, corta. Puede cortar con extremos
romos o con extremos cohesivos (quedan bases desapareadas)
➔ Entonces, son fosfodiesterasas, porque cortan los enlaces fosfodiéster, y lo hacen
en doble cadena.
o Una vez que se realizó el corte, se usa Electroforesis (se sumerge la muestra en el gel)
o Para comprobar si las ER, reconoció o no la secuencia de interés, uso Electroforesis.

Interpretación:
→ 1 banda: no cortó.
→ 2 bandas: hubo 1 corte.
➔A partir de si cortó o no cortó, sigo haciendo otras inferencias.

Southern Blot
→Técnica que permite estudiar fragmentos pequeños y definidos del ADN. (1 gen o
segmentos menores). Se obtienen Fragmentos de Restricción.
→Permite evidenciar la presencia de determinadas secuencias en el genoma.
→Puede detectar inserciones o deleciones en las secuencias de ADN.
→Utiliza enzimas de restricción, que van a cortar al ADN, en los sitios de restricción.
o Se somete a los fragmentos en electroforesis en gel, en donde los mas pequeños migran
más rápido que los más grandes.
o Luego, se desnaturaliza el ADN (pasa de tener forma bicatenaria a monocatenaria)
o Se transfieren los fragmentos a una membrana de nitrocelulosa (blotting)
o Agrego sondas (hebras pequeña de ADN monocatenarias, de secuencia conocida),
marcadas con radioactividad o fluorescencia.
o Si las sondas se unen, es que la sonda fue complementaria, y va a evidenciar la
fluorescencia.