UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

“Año del Fortalecimiento de la Soberanía Nacional”

BIOLOGÍA MOLECULAR
DOCENTE: Dr. JORGE VICTOR WILFREDO CACHAY WESTER

PRÁCTICA N°1

“Identificación y descripción del material biológico y

de laboratorio utilizado en Biología Molecular”

Grupo 1: Camacho Jara Jefrey

Fernández Cortez Patrick
Hinojosa Atalaya, Venus
Ruiz Ríos Ruth
Vargas Llanos Angie

Lambayeque, 12 de enero del 2022

 INTRODUCIÓN
Siendo la Biología Molecular una disciplina científica que estudia los procesos de
organismos vivos a nivel molecular, las técnicas que se requieren en su estudio son
realizadas en un laboratorio debidamente equipado, que se rige por un protocolo
internacional de bioseguridad a fin de proteger la integridad del personal. Para lo cual,
toda persona que ingrese a practicar en el laboratorio, debe tener conocimiento previo
acerca de la indumentaria correspondiente y las precauciones ante el manejo de insumos
e instrumentos.

Partiendo del material a estudiar, la colecta constituye uno de los puntos de partida para
llevar a cabo una investigación. Se necesita realizarla de modo que la muestra no se
contamine y, en consecuencia, arroje resultados erróneos. Por lo que, la indumentaria a
usar, más allá de evitar contaminación cruzada, sirve como protección misma a quien la
porte. Pues, tratándose de material biológico y personal humano, la bioseguridad resulta
sumamente importante.

Luego, ya en el laboratorio, es sabido que existe un manejo de reactivos para determinar

o identificar según lo deseado. Estos reactivos no solo son los que llegan en el empaque,
muchos pueden ser un preparado que solo el encargado o especialista debe trabajar a fin
de evitar riesgos o accidentes en los estudiantes. Algo similar ocurre con los equipos
que, si bien llevan consigo un manual, también conllevan un manejo adecuado para
conseguir óptimos resultados.

Es por ello, que la presente práctica reúne los conocimientos básicos requeridos y
necesarios sobre los protocolos existentes en el laboratorio, y particularmente, de
Biología Molecular.

OBJETIVOS

o Reconocer las muestras a estudiar, así como los instrumentos y demás materiales
correspondientes al Laboratorio de Biología Molecular.
o Adquirir conocimiento acerca del buen manejo de muestras colectadas y materiales del
laboratorio siguiendo los protocolos de Bioseguridad.
o Obtener la capacidad sobre colecta de muestras y su debido procesamiento.
 RESULTADOS
a. Colecta de muestra
1. Describir y esquematizar el procedimiento de colecta de muestra sanguínea por
punción dactilar.

Procedimiento de colecta de muestra sanguínea por punción dactilar

3
1 2

4 5 6

1. Lávese bien las manos y póngase guantes bien ajustados. Rotule el portaobjetos
con los datos del paciente.
2. Sostenga la mano izquierda del paciente, con la palma hacia abajo y seleccione
el tercer dedo a partir del pulgar.
3. Desinfectar y secar completamente el sitio de punción.
4. Punce directamente la yema en el dedo con una lanceta estéril.
5. Deseche la primera gota y límpiela con algodón y alcohol, cuidando de no dejar
en el dedo hebras de este que podrían adherirse a la sangre (Salud O. M., 2016)
6. Proceder a hacer los extendidos u obtener sangre para su correspondiente
análisis.
(Salud, 1995)
2. Describir y esquematizar el procedimiento de colecta de muestra de células
epiteliales de la cavidad bucal

Póngase guantes de látex y mascarilla.

Asegúrese de que todos los elementos para
realización de la prueba estén disponibles y
al alcance de la mano.

Raspamos con un hisopo la mucosa interna

de la mejilla de la boca del paciente.

Depositando el producto extraído en el

centro de un portaobjetos con una gota de
agua.

Procede a teñir y colocar el portaobjetos.

Colocamos la muestra preparada en la
platina del microscopio. (Biología, 2018)
3. Describir el procedimiento de colecta de muestras foliares en plántulas juveniles
o cultivadas in vitro
Colecta de muestras foliares en plántulas juveniles
La toma de muestras debe realizarse de una manera apropiada, con el fin de asegurar una
muestra representativa para efectuar un buen análisis y diagnóstico. Se deben llevar 300
g de muestra al laboratorio en bolsa plástica perforada y debidamente rotulada.

• Metodología para la toma de muestras de hojas.

Antes de proceder a tomar las muestras, se deben diferenciar dentro de cada parcela zonas
en relación a las características del suelo (textura, profundidad, fertilidad, color, etc) y de
la uniformidad del arbolado (combinación variedad/patrón, edad, porte, color del follaje,
producción, etc.). El número de muestras a tomar será el mismo que el número de zonas
diferentes observemos dentro de la parcela.

A continuación, dentro de cada zona diferenciada se seleccionarán los árboles que serán
objeto de muestreo. Éstos no deben presentar daños por plagas, enfermedades, haber
sufrido encharcamiento o sequía o haber sido abonados recientemente pues, los resultados
pueden verse alterados. Se debe muestrear como mínimo un 2% del área que ocupe cada
zona de muestreo.

Una vez seleccionados los árboles a muestrear, las hojas deben tomarse a una altura que
corresponda a la mitad de la copa. Se tomará una hoja por cada punto cardinal (4 hojas
por árbol). Éstas deben tener una edad comprendida entre 6 y 7 meses lo que suele
corresponder a la hoja más baja de un brote nuevo (Figura 1). Las hojas muestreadas no
deben proceder de brotes fructíferos.

Figura 1. Selección de hoja para muestreo

El muestreo debe realizarse inmediatamente después de la cosecha y antes de la poda. No
obstante, si fuera de la época ideal de muestreo, se observan zonas de menor crecimiento,
menor producción, presencia de quemaduras o coloraciones anormales en las hojas, etc,
se puede realizar un análisis enfocado a determinar la causa que lo provoca.

Para muchos cultivos las interpretaciones están basadas en el muestreo de la "Hoja

Madura Más Reciente" (HMMR). La HMMR es la hoja totalmente expandida u hoja
madura y es generalmente de la tercera a la quinta hoja abajo del punto de crecimiento.
(col, 2016)

4. Describir el procedimiento de colecta de colonias microbianas o fúngicas para

replicación o extracción de material genético.

Colecta de colonias fúngicas para replicación o extracción de material genético

• Muestreo del suelo
Las condiciones del suelo, desde la recolección hasta la culminación del experimento se
debe considerar, debido a que la temperatura, la disponibilidad de oxígeno, el contenido
del agua y la duración del almacenamiento afecta enormemente a la microflora del suelo
y de esta manera los procesos que en ellos intervienen. Tienen que asegurar que el número
y las actividades de los microorganismos no se alteran, ya sea positiva o negativamente,
de manera no cuantificable durante la recolección y la conservación de la muestra.

• Toma de muestras
El muestreo al azar es el más sencillo, debido a que consiste en recolectar submuestras
que luego son mezcladas para lograr una muestra compuesta. El inconveniente de este
tipo de muestro es que frecuentemente no se tiene en cuenta la variabilidad existente en
sectores no homogéneos del lote.

Luego de haber seleccionado el tipo o método de muestreo, es necesario escoger la

herramienta a utilizar para la recolección de la muestra de suelo. Las muestras serán
rotuladas correctamente y colocadas en bolsas plásticas. (Arias Cifuentes & Piñeros
Espinosa, 2008)

5. Describir el procedimiento de almacenamiento de cada tipo de muestra biológica

mostrada en clase.

• Muestra sanguínea por punción dactilar y de células epiteliales de la cavidad

bucal

En general, las muestras deberán guardarse en un lugar limpio, seco, oscuro, fresco y
suficientemente ventilado. Habrá que controlar con regularidad la temperatura de
almacenamiento. La temperatura de estas instalaciones no podrá ser inferior a 0 °C ni
superar los 30 °C.

Analizar las muestras lo más pronto posible después de su llegada al laboratorio; si esto
no es posible se recomienda, para la mayoría de muestras, almacenamiento a 4° C.

• Muestras foliares en plántulas juveniles o cultivadas in vitro

Antes de introducir las muestras en bolsas para su envío al laboratorio, es conveniente

secarlas con papel absorbente para eliminar el exceso de humedad que pueda provocar la
podredumbre de las hojas y favorecer la aparición de hongos. Cada muestra debe estar
debidamente identificadas y enviarse al laboratorio lo antes posible. Lo ideal es enviarlas
el mismo día en que se tomen.

Se recomienda empacar las muestras en bolsas de papel, nunca empacar en bolsas de

plástico.
Si el envío no puede hacerse en las siguientes 48 horas, se pueden conservar los sobres
(abiertos) en el frigorífico hasta 10 días. Para el envío no se requiere frío, se pueden enviar
las muestras a temperatura ambiente.

• Colecta de colonias microbianas o fúngicas para replicación o extracción de

material genético.

La muestra debe pasarse a través de un tamiz de 2mm para facilitar el intercambio gaseoso
entre las partículas. Así mismo, el suelo se debe desmigajar y voltear con frecuencia a
temperatura ambiente, para evitar secado excesivo en la superficie.
Seguidamente, las muestras deben ser almacenadas en oscuridad a 4°C a 2°C con acceso
de aire libre y el uso de bolsas plásticas amarradas en forma holgada.

La determinación del porcentaje de humedad se realiza por diferencia entre peso húmedo
y peso seco. Se toman 2 g por duplicado de cada muestra y se colocan en horno a
temperatura de 100°C durante dos horas.

Seguidamente, cuando desciende la temperatura, las muestras son pesadas y luego

llevadas nuevamente al horno para continuar con el secado. Dos horas después son
nuevamente pesadas en frío y se repite el procedimiento hasta que el peso se estabilice.

B. Identificación de los materiales de laboratorio y equipos de protección personal

1. Materiales de plástico y vidrio:

• Lanceta para punción dactilar

Las lancetas se utilizan para hacer punciones en la
yema del dedo (preferentemente el índice), para
obtener pequeñas muestras de sangre y son
generalmente desechables.
• Tubo de colecta al vacío (Vacutainer) de 4 mL con EDTA (tapa morada)
Es un tubo de vidrio y plástico PET, cerrado al vacío
con un tapón de plástico blando, el cual permite que le
atraviese una aguja con ligera presión. Los tubos
vacutainer de tapa morada contienen EDTA
(etilendiaminotetraacético) que es una sustancia
anticoagulante, la cual permite que la muestra de
sangre pueda ser utilizada luego para su procesamiento.

• Frasco para colecta de muestras vegetales

Frascos usualmente de plásticos, esterilizados con
tapa que cierra herméticamente.

• Hisopo estéril para colecta de células

Hisopo hecho de poliéster con un largo usualmente de
10 cm. Este objeto permitirá realizar hisopados para
tomar muestras, que luego será depositado en un tubo
apropiado con el medio de mantenimiento apropiado
para la conservación o transporte.

• Punteras o “tips” para uso con micropipeta

Hechas de plástico descartable que se utilizan para
tomar una pequeña muestra de líquido o solución.
Esta debe encajar perfectamente en la micropipeta sin
ser necesario apuntar la punta sobre la pipeta.
• Tubos falcon de 15 mL y 50 mL descartables
Son tubos cónicos para la centrifugadora, probados
para resistir la centrifugación de 12000 RCF.

• Microtubos eppendorf de 1.5 mL, 0.2 mL

Los microtubos graduados de polipropileno incluyen una
tapa con bisagra con un gancho pequeño que encaja
alrededor del borde del tubo. Ideales para manipular de
forma segura muestras valiosas y tóxicas, así como
sustancias radiactivas y ADN.

• Placas de 96 pozos para PCR en tiempo real

Placas hechas de poliestireno, los pozos pueden tener
fondo redondo, cónico o plano. Cada placa lleva un
envase para protegerlo de los contaminantes del aire.
Es ideal para archivo de muestras y trabajos
enzimáticos. Los pozos están dispuestos en un estándar
de 12x8 con configuración alfa-numéricas.

• Pipeta de Pasteur
Hecha de plástico descartable y sirve para hacer la
transferencia de pequeñas cantidades de líquidos y no es
necesario una gran precisión.
• Probetas de 50 mL y 100 mL
Instrumento en forma de tubo fabricado de vidrio que
permite contener líquidos y suelen estar graduadas
permitiendo medir un determinado volumen con
exactitud. En la parte inferior está cerrado y posee una
base que sirve de apoyo, mientras que la superior está
abierta y suele tener un pico.

• Pipetas de 5 mL y 10 mL
Instrumento fabricado de vidrio, con forma delgada
y alargada; en una de sus terminaciones es de forma
cónica, y está graduada. Permite medir y trasvasar
líquido.

• Vaso de precipitación de 100 mL y 500 mL

Es un recipiente de forma cilíndrica y posee un fondo
plano, con una pequeña boca en la parte de arriba para
poder transferir el líquido que contiene con mayor
facilidad. Pueden ser de vidrio pyrex, vidrio normal o de
plástico. Poseen componentes de teflón y otros
materiales resistentes a la corrosión. Usado mayormente
para calentar sustancias o líquidos.

• Balón de ebullición de 100 mL

Frasco de vidrio de cuello largo y cuerpo esférico. Diseñado

para calentar su interior uniformemente. Su base redondeada
permite agitar o remover fácilmente su contenido sin poder
derramar ninguna sustancia fuera del envase.
 • Láminas portaobjeto y cubreobjeto
Los portaobjetos son finas láminas de vidrio sobre las
cuales se colocan las muestras o preparaciones que
posteriormente se pretenden analizar y observar con un
microscopio. Por su parte, el cubreobjetos es una placa
en forma cuadrada o rectangular muy delgada y
transparente, que se coloca sobre la muestra y el
portaobjeto. Sirve para fijar la muestra y evitar que se
mueva fuera del alcance de nuestra observación.

2. Equipos de protección personal utilizados en el laboratorio de Biología

Molecular.

• Cofia o toca de material descartable

Las cofias son gorros desechables, generalmente
fabricados en tela no tejida de polipropileno o cualquier
otro material siempre que sus fibras no sean textiles. Cada
cofia está rodeada en todo su contorno por una goma
elástica para que quede ajustada alrededor de la cabeza.

• Lentes de protección ocular

Las gafas de protección, son un tipo especial de
anteojos que se utilizan para proteger párpados y ojos
de la acción corrosiva de algunas sustancias o de la
entrada en estos de alguna viruta procedente de algún
trabajo de maquinado o similar.

• Mascarilla, tapa bocas o máscara quirúrgica descartables

Mascarilla que brinda protección contra partículas

sólidas, líquidas y muy tóxicas. También nos protege de
la inhalación de gases nocivos para la salud.
 • Guantes de látex sin talco
Estos guantes están especialmente indicados para los
trabajos en el laboratorio ya que ofrecen unos altos niveles
protección a las manos ante las sustancias manipuladas en
el laboratorio. También protegen de elementos con
diferentes niveles de toxicidad.

• Mandil o bata de laboratorio

El guardapolvo es una pieza de ropa amplia y larga que

sirve en un laboratorio para protegerse de cualquier daño
que puedan hacer las sustancias químicas a la ropa o a
las personas. Debe ser de un material resistente ya que
nos resguarda de sustancias químicas o corrosivas, y
algunas agentes biopeligrosos. El mandil es con mangas
largas, de esa manera proteger los brazos.

C. Identificación de los equipos de laboratorios y reactivos utilizados en Genética

Molecular

1. Equipos de laboratorio

• Termociclador en tiempo real

El termociclador es un aparato con capacidad para
calentar y enfriar rápidamente las muestras, de modo que
se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los
ácidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN
polimerasa. Con este equipo se puede realizar la PCR
cuantitativa, ya que posee capacidad de hacer incidir
sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda
determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el
fluorocromo excitado.
 • Equipo de PCR digital por gotas
Este equipo puede ser usado para cuantificar
de manera precisa y reproducible los
microácidos ribonucleicos (miARN), en
plasma y suero, en diferentes días. La PCR
digital tiene muchas ventajas sobre la qPCR
incluyendo la capacidad de proporcionar una
cuantificación absoluta sin una curva
estándar y robustez a las variaciones en la
eficiencia de la PCR para diferentes
muestras y análisis.

• Secuenciador Sanger Automatizado

Es un instrumento automático para el estudio
del orden de los de nucleótidos del ADN
capaces de secuenciar varios cientos de
muestras marcadas por fluorescencia en una
sola vez llevando a cabo 24 ciclos de
secuenciación al día; llevan a cabo la
separación del ADN basada en el tamaño, la
detección y el registro de la coloración
fluorescente, apareciendo los datos
resultantes como cromatogramas que
registran los picos de fluorescencia.

2. Almacenamiento y descarte de los reactivos que se utilizan en el laboratorio de

Biología Molecular.

Los reactivos de laboratorio se pueden almacenar en estanterías a temperatura ambiente;

también en un frigorífico los que necesiten mantenerse refrigerados; incluso en almacenes
propiamente dichos.

El almacenamiento de los reactivos se realiza teniendo en cuenta el nivel de riesgo de

estos (tóxicos, inflamables, corrosivos y de bajo riesgo), de esta forma los reactivos más
peligrosos irán atrás en la estantería y los de riesgo bajo adelante. También se debe tener
en cuenta la ficha técnica o ficha de seguridad de cada reactivo, para así conocer las
incompatibilidades de cada uno.

Para descartar los reactivos de laboratorio se deben estar depositados en contenedores que
sean resistentes a la naturaleza del mismo. Generalmente para envasar los residuos
químicos que puedan se potencialmente peligrosos se utilizan contenedores de polietileno
de alta densidad, polipropileno, botellas de vidrio y recipientes de acero inoxidable. Para
su posterior extracción encargada por personas o institución especializadas en la
eliminación de desechos de laboratorio.
 CONCLUSIONES

En base a la revisión bibliográfica, se logró conocer ejemplos de muestras biológicas,

así como los instrumentos y reactivos básicos o más comunes, presentes en el
Laboratorio de Biología Molecular.

Con la lectura, los autores del presente informe concluyeron en la importancia que tiene
el conocimiento sobre la normativa de Bioseguridad que rige en los laboratorios, a fin
de realizar adecuadamente las prácticas.

Se puede afirmar que se obtuvieron conocimientos necesarios sobre los pasos que se
realizan para lograr una correcta colecta del material biológicos a estudiar.

Sin embargo, cabe resaltar que la revisión bibliográfica no es determinante para

asegurar un excelente trabajo por parte del estudiante, pues la práctica no se llevó a cabo
apropiadamente en un laboratorio.

CUESTIONARIO

a. ¿Qué tipos celulares encontrados en la sangre venosa aportan para la

obtención de ácido desoxirribonucleico?

En los estudios moleculares se realiza la extracción de los ácidos nucleicos del paciente,
por lo que factores como la dieta, el ejercicio físico, el horario de toma de muestra, etc,
no influyen en la calidad de los resultados como ocurre en otras pruebas de laboratorio
clínico. En nuestro medio, los análisis de biología molecular vinculados a enfermedades
oncohematológicas se realizan en sangre venosa o medular. La sangre venosa, que se
obtiene por punción de una vena periférica de fácil acceso como la del pliegue del codo,
se emplea generalmente para la extracción del ácido desoxirribonucleico (ADN), para la
exploración de la presencia de la mutación JAK2V617F y del quimerismo en los pacientes
que han sido trasplantados con células hematopoyéticas. La sangre que procede de médula
ósea, con mayor contenido de células mononucleadas, es la recomendada para la
extracción del ARN que se destina para el estudio molecular de las leucemias.

La toma de muestra se debe realizar con precaución para evitar la contaminación con
material genético ajeno al paciente. El uso de guantes es imprescindible desde este primer
momento, en particular cuando se trabaja con ARN para eludir las ARNasas presentes en
la piel. Del mismo modo, deben evitarse todas las causas de error relacionadas con esta
etapa, que van desde una incorrecta identificación de la muestra hasta su hemólisis. Por
ello, el personal que ejecute la toma de muestra debe estar calificado para realizar dicho
proceder.

b. ¿Cómo podemos mantener la integridad del ADN o ARN de una muestra

biológica?

Para mantener la integridad del material genético de una muestra biológica mayormente
se realiza la congelación de dicha muestra ya que en algunos casos el uso de otros
reactivos puede degradar el material genético o acarrear contaminantes que dificultaran
la purificación y extracción de dicho material genético. (Alejos et al., 2015)

El procedimiento que se sigue para conservar una muestra biológica depende de la

muestra con la cual se trabaje. En caso de trabajar con tejido vegetal, por ejemplo, tejido
foliar es mejor recoger el tejido joven ya que tiene más células por peso y menos
compuestos que dificulten la extracción, este tejido debe congelarse en nitrógeno líquido
evitando así que se formen cristales o metabolitos secundarios, se recomienda congelar
varios paquetes que se mantendrán a -80 °C, estos deben contener la cantidad de muestra
a procesar, para así evitar los ciclo de congelado y descongelado, ya que esto puede
degradar el material genético. Hay excepciones como el caso de los cultivos in vitro dende
la extracción puede ser directa y no se necesita conservar la muestra. Otra forma es
liofilizar la muestra y almacenarla a temperatura ambiente, pero dicha técnica no es
aplicable para suculentas. (Alejos et al., 2015)

En caso del tejido animal, es necesario cortar el tejido en trozos pequeños de

aproximadamente medio centímetro para que sea más fácil el proceso de maceración
posterior. En ese caso se pude deshidratar con etanol al 70% pero esto como se mencionó
pude degradar el material genético o contaminar la muestra, por ello es preferible
congelarlo con nitrógeno líquido, también es recomendable usar un buffer que inactivé
las endonucleasas, o también se pude homogeneizar con buffer de lisis con sales de
guanidina que inhiban las DNasas y RNasas. Estas muestras deben almacenarse a 4°C en
etanol y a -80 C en nitrógeno líquido, siguiendo su método de colecta. (Alejos et al.,
2015)

En el caso de la sangre su conservación depende de la relación muestra/anticoagulante y

de la homogeneización de la muestra, ya que es muy importante evitar la hemólisis pues
la hemoglobina actúa como contaminante que inhibe las reacciones enzimáticas, además
es importante evitar la coagulación ya que el fibrinógeno puede enlazar células evitando
una lisis adecuada, las reacciones enzimáticas que producen la coagulación depende del
calcio, por ello se usan anticoagulantes como el EDTA que elimina el calcio e inhibe
algunas enzimas, se usa en proporción 1 mg/ml de sangre; la heparina que actúa sobre la
protrombina, se utiliza en proporción de 0.1-0.2 ml de heparina saturada por cada mililitro
de sangre y el citrato de sodio que evita la ionización del calcio, se usa a una concentración
de 0.106 mol/l. Para el transporte de la muestra es necesario evitar movimientos bruscos,
y dicha muestra puede mantenerse unos días a 4°C, si se procesara luego de un periodo
más largo se recomienda separar la muestra en alícuotas y congelarse a -20, ya que caso
contrario una vez se descongele a temperatura ambiente se iniciará la hemolisis y se
deberá procesar toda la muestra. (Alejos et al., 2015)

c. ¿Cuáles son los procedimientos experimentales aplicados a Genética

Molecular que podemos realizar utilizando el Secuenciador Sanger
Automatizado?

El método propuesto por Sanger-Coulson, o de terminación de la cadena, se basa en la

síntesis secuencial de una hebra de ADN complementaria a la hebra de cadena simple
cuya secuencia quiere determinarse, residiendo la clave del método en la adición de
dideoxinucleótidos o nucleótidos de parada a la mezcla de la reacción ya que, al carecer
estos nucleótidos del grupo 3’-OH, su adición resulta en la interrupción de la síntesis. Así,
la secuenciación de Sanger-Coulson consiste en llevar a cabo 4 reacciones independientes
conteniendo cada una de las mezclas de reacción la hebra molde, la ADN polimerasa, un
cebador marcado, los cuatro 2’-deoxinucleótidos (dNTP) y uno de los cuatro
dideoxinucleótidos (ddNTP) en menor proporción.

El método de terminación de cadena fue bien acogido en la comunidad científica y su uso

se extendió casi de forma inmediata. Los avances tecnológicos que acontecieron en años
posteriores hicieron que en 1987 saliera al mercado el primer secuenciador Sanger
automatizado capaz de generar hasta 1000 pares de bases al día, cuya principal diferencia
con el método descrito originalmente radicaba en la sustitución del marcaje radiactivo de
los cebadores por el uso de ddNTPs marcados con 4 fluoróforos distintos lo que permitía
realizar la secuenciación en una sola mezcla de reacción eliminando además la generación
de residuos reactivos. Cabe destacar también, que estos secuenciadores sustituían la
electroforesis en geles de poliacrilamida por la electroforesis capilar e incorporaban la
técnica de la reacción en cadena de la polimerasa descrita por Mullis en 1983. La
automatización de la secuenciación Sanger supuso una revolución en el campo de la
genética humana, actuando como catalizador de proyectos tan ambiciosos para la época
como el Proyecto Genoma Humano; proyectos que, a su vez, han propiciado el desarrollo
de nuevas generaciones de secuenciadores.

d. ¿En qué se diferencia un Termociclador convencional y un equipo de PCR

digital por gotas?

La principal diferencia de los equipos mencionados, es que un termociclador

convencional (TMc) solo se usa para amplificar el ADN mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), en dicho proceso se obtiene gran número de copias de un
fragmento de ADN, el cual puede ser usado en técnicas de fenotipado, secuenciación y
clonación; por otro lado, el equipo de PCR digital por gotas (ddPCR), es usado para
diversas aplicaciones tanto investigativas como clínicas ya que permite cuantificar de
manera absoluta las secuencias de ácidos nucleicos, la expresión génica e incluso para
detectar alelos extraños, la precisión necesaria para detectar estas mínimas variaciones se
logra por el encapsulamiento de las unidades de moléculas de ADN. (Quispe, 2020; Bio-
Rad, 2017)

Dado que un TMc solo puede medir la cantidad de producto que se acumula al final de
los ciclos, esto mediante la observación de la intensidad de las bandas que a lo mucho
solo permite obtener resultados semicuantitativos, ya que él bromuro de etidio no
cuantifica bien el resultado ya que tiene poca precisión y baja resolución para detectar
resultados tan específicos, además la ADN polimerasa que se usa en la reacción solo pude
procesar activamente pequeños fragmentos de ADN por lo que requiere un procesamiento
posterior para obtener resultados aplicables a la investigación o diagnóstico clínico.
(Quispe, 2020)

Por otro lado, la ddPCR determina la contracción de copias absolutas del ADN diana al
medir tanto micro reacciones negativas como las positivas y compararlas, lo cual pude
ser cuantificado con el algoritmo Poisson brindándonos así resultados altamente
precisos, sin embargo, esta precisión depende del número de repeticiones del PCR que
se realicen y a diferencia de la técnica tradicional, la ddPCR pude ser usada para
analizar mezclas complejas, ya que puede detectar mutaciones o secuencias raras, esto
es posible gracias a las particiones en gotas de agua en aceite ya que el conteo de las
moléculas de ADN contenidas dentro permite detectar las pequeñas diferencias de
cambio de pliegue en el ADN, lo que a su vez elimina el sesgo y reduce las tasas de
error. (Bio-Rad, 2017)
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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y purificación de ADN. 1ra ed. 1-2.
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