TECNICAS HISTOLOGICAS

Las Técnicas Histológicas abarcan diferentes procedimientos a los cuales son sometidos los
tejidos para obtener preparados histológicos, y poder estudiarlos por medio de la microscopía
óptica o electrónica.

DEFINICIÓN: Es un conjunto de pasos a seguir para la obtención de preparados histológicos

aptos para su estudio mediante el microscopio, posibilitando la observación de estructuras no
visibles al ojo humano.

PASOS:

1-Obtención del material

2- Fijación

3- Deshidratación

4- Aclaración

5- Imbibición

6- Inclusión en parafina,

bloque y taco

7- Corte

8- Tinción

9- Montaje y observación

DESARROLLO

1-Obtención del material:

• Material de Biopsias

• Material obtenido de necropsias

• Animales de laboratorio

• Cultivos de tejidos

• Extendidos citológicos

Examen inmediato o in vivo:

a) En fresco: animales unicelulares y células libres. Plasma Sanguíneo, Albúmina, Humor

Acuoso, Líquido Amniótico, Soluciones Fisiológicas, Orina.

b) Coloración vital: usando soluciones de colorantes no tóxicos (colorantes vitales), coloración

intravital o in vivo, y la coloración supravital, donde pueden colorearse células libres o
porciones de órganos.
Examen mediato o post-mortem:

Requiere de la muerte celular y supone seguir una serie de pasos: La Técnica histológica:

- Debe ser rápida.

- Hay que tener en cuenta las características del órgano (muy hidratado, contráctil,
colapsa, etc)

El Material se puede obtener de:

- Biopsia.
- Autopsia

2- Fijación
La fijación es el proceso mediante el cual:
- Se evitan los procesos de putrefacción o lisis.
- Se conservan las estructuras del tejido a estudiar, lo más semejante posible al
estado vivo.
- Confiere a los tejidos una consistencia adecuada para su ulterior sección o
corte.
La fijación se realiza, sumergiendo el material en un líquido fijador. En cualquier caso,
la fijación debe ser inmediata, ya que al detenerse los procesos vitales o privarse de
circulación al tejido se produce una serie de cambios post-mortem o autolíticos
(degradación por factores endógenos).
Fundamentos de la fijación
- Evitar los procesos de lisis y putrefacción post- mortem.
- Evitar la proliferación bacteriana.
- Conservar las estructuras lo más parecido posible al estado vivo.
- Preparar las estructuras para los tratamientos próximos (inclusión, coloración,
etc).
- La fijación detiene los procesos vitales pero en ciertas condiciones mantiene las
actividades de algunos componentes moleculares, por ejemplo la actividad de
algunas enzimas.
- Insolubilizar sustancias solubles.
- Dar cierta solidez o dureza al tejido o material.
¿A que llamamos fijador?
Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agentes físicos que se utilizan para
fijar una muestra orgánica.
Cualidades que debe tener un fijador
- Actuar con rapidez y detener los procesos autolíticos.
- Buen poder de penetración.
 - Conservar lo más fielmente la estructura del tejido.
- No interferir y facilitar los procesos posteriores.
- Endurecer el tejido y darle mayor consistencia.
- Insolubilizar los componentes de los tejidos.
- No producir estructuras artificiales.

Clasificación de los fijadores

Desecación
Calor (microorganismos)
Calor (Coagulan proteínas)
Fijadores Se somete el preparado a
Físicos congelamiento con aire
Frío líquido a -
170°C.
Congelación y desecación
Son soluciones de una sola
Fijadores Simples sustancia en diluciones
acuosas.
Químicos Combinación de varias
(son líquidos) Compuestos
sustancias
o mezclas
simples.

Ejemplo de soluciones fijadoras

Simples Mezclas o compuestas
Formol Formol tamponado
Alcohol etílico según Backer
Acido acético Formol tamponado
Ácido pícrico según Lillie
Tetroxido de osmio (ME) Bouin Gendree
Glutaraldehido (ME) Zenker
 Para la elección de un fijador se debe tener en cuenta
La velocidad de difusión es un fenómeno físico y la velocidad de fijación es un
fenómeno químico y equivale al tiempo y al tamaño de la pieza al que se debe someter
A- Velocidad de las piezas en el fijador. Ejemplo: el formol difunde rápidamente, pero fija lentamente,
difusión por lo que las piezas pueden permanecer en el fijador mucho tiempo. El glutaraldehído
tiene velocidad de difusión lenta, pero fija muy rápido, por lo tanto, las piezas deberán
ser de tamaño pequeño y permanecerán poco tiempo en el fijador.
B- El coeficiente
Los fijadores, endurecen los tejidos, esto es conveniente, pero no deben sobrepasar el
de
límite compatible con la obtención de cortes.
endurecimiento
C- Variaciones del
Es necesario elegir un fijador cuya presión osmótica sea cercana a la de la muestra, para
volumen y
evitar distorsiones de las estructuras celulares.
presión osmótica
D- Efecto Los organoides de las células no pueden teñirse, en este caso hay fijadores que facilitan
mordiente el proceso de tinción de esas estructuras que, de otra forma, no se tiñen.

3- Deshidratación
Se elimina toda el agua contenida en los tejidos, ya que el agua impide la difusión de la
parafina al interior del tejido.
Consiste en pasar el material fijado, por una serie de alcoholes de concentraciones
crecientes (50%, 70%, 80%, 96% y dos baños en alcohol 100% o absoluto).
4- Aclaramiento o diafanización
Consiste en someter el material ya deshidratado, a dos baños consecutivos en
solventes orgánicos como el xilol, toluol, benceno, etc., con el objetivo de favorecer la
difusión de la parafina en el interior del tejido, ya que la misma es poco soluble en el
alcohol.

Deshidratación y Aclaramiento

5- Imbibición
Es impregnar la pieza con una sustancia que le confiere dureza y permite obtener
cortes uniformes y delgados.
El objetivo de esto es brindar posteriormente un soporte sólido que permita el corte
del tejido en delgadas capas.
Imbibición en Parafina

- En la técnica corriente, se utiliza la PARAFINA (insoluble en agua)

- El material aclarado, es colocado en un recipiente con parafina líquida, la cual se
mantendrá en ese estado dentro de una estufa a 56°- 58°C.
- Se efectúan dos baños consecutivos, uno de 12 horas y otro de 4 horas de
permanencia del material dentro la parafina.
- Esto permitirá que la parafina difunda dentro del tejido.

6- Inclusión en parafina, bloque y taco

El material ya embebido, se coloca en el fondo de un recipiente, y se llena el mismo
con parafina líquida hasta el borde y se deja solidificar a temperatura ambiente. De
esta manera se forma un bloque, donde el material se encuentra incluido en un
soporte de parafina.
El bloque, luego se pegará sobre un taco de madera con los datos correspondientes,
que servirán de registro del material.
Tallado
Para eliminar exceso de parafina .
Se elimina la parafina con un cuchillo, dando al taco la forma de una pirámide truncada, con el
objeto de que no ofrezca resistencia al ser cortado en el micrótomo.

7- Corte
Para cortar el material histológico, se utilizan los micrótomos. Estos son dispositivos
mecánicos que enfrentan el taco con el material a la cuchilla, de tal modo que se
produce un avance regular y controlado, para obtener cortes sucesivos de grosor fino y
uniforme, generalmente de 3 a 8 micras [una micra es la milésima parte de 1 mm, es
decir 1µ= 10-3 mm o 10-6 m].
Estructuralmente los micrótomos, constan de:
*Un dispositivo llamado platina o porta- espécimen o portabloque, con pinzas para
sujetar el taco de madera con el preparado.
*Un soporte donde se inserta la cuchilla o portacuchilla, rígidamente sostenida por
medio de pinzas o tornillos.
*Un tornillo micrométrico, con el que se selecciona el espesor al que se desee cortar
(en µ), y cuyo avance actúa sobre la platina con el material.

Tipos de micrótomos
Micrótomos para parafina:

a- El micrótomo de deslizamiento: que presenta cuchilla móvil y platina fija

b- El micrótomo de rotación o tipo Minot: que presenta cuchilla fija y platina móvil.

c- Micrótomo de congelación: Presenta una platina fija y una cuchilla móvil, además de un
sistema de congelación del material, mediante un tubo con CO2, que llega al micrótomo por
una manguera hasta la platina. Esta técnica es muy útil para el diagnóstico durante el acto
quirúrgico, permitiéndole al cirujano tomar decisiones rápidas.

d- Crióstato: Consta de un micrótomo tipo Minot incluido dentro de una cámara de

congelación. El volante o manivela que controla la realización del corte permanece en el
exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance están situados dentro de la cámara
fría (normalmente -20°C).
Correlación Clínica:
Biopsias por congelación
Sirven para:
- Evaluar de inmediato la pieza obtenida durante el acto quirúrgico lo que determinará
la conducta a seguir.
- Identificar hallazgos intraoperatorios inesperados
- Evaluación de márgenes de la resección quirúrgica.
Para realizar una biopsia por congelación se siguen tres pasos principales:
- Congelación del tejido. Se congelan muestras de tejido de tamaño pequeño mediante
el uso de dióxido de carbono sólido o mediante inmersión en un líquido frío
(isopentano) a una temperatura de –50 °C.
- Corte del tejido congelado. El corte suele realizarse dentro de un criostato. Dado que el
tejido está congelado, se puede cortar en rebanadas muy finas (5 nm a 10 mm).
- Tinción de los cortes. Las tinciones de uso más frecuente para las biopsias por
congelación son H&E, el azul de metileno y tinción de PAS.
- Todo el proceso puede tardar 10 minutos y el resultado se comunica al cirujano
inmediatamente.

8- Tinción o Coloración
Cuando se observan al microscopio, los preparados frescos o los post-mortem, solo se
diferencian los elementos que poseen distintos índices de refracción, mientras que los
elementos con índice de refracción semejante se verán iguales, lo que puede confundir al
observador. Por lo tanto, para poder ver los distintos tipos de células y reconocer su
organización y su relación con sustancias y fibras extracelulares, es necesario el uso de
colorantes.

Colorante: es toda sustancia capaz de ceder su coloración a otros cuerpos.

- En los colorantes hay grupos químicos que le confieren color (grupos cromóforos) y
otros que reaccionan con los componentes del tejido y células, fijando el color a estas
estructuras. Estos grupos pueden ser: básicos (grupo amino) o ácidos (grupo
carboxilo).
Clasificación
1-Colorantes naturales: cuando son obtenidos de organismos vivos, los
que pueden ser de:
a) animales: carmín.
b) vegetales: hematoxilina, orceína.

2-Colorantes artificiales o sintéticos (colorantes de anilina):

a) ácidos: poseen una carga global negativa (aniónicos), reaccionan con los componentes
catiónicos de las células. Son los colorantes citoplasmáticos. Ejemplo: eosina, fucsina ácida.
b) básicos: poseen una carga global positiva (catiónicos), reaccionan con los componentes
aniónicos de las células. Son los colorantes nucleares. Ejemplo: fucsina básica, azul de
Toluidina, azul de Metileno.
c) neutros: son colorantes que presentan sus sales ácidas y básicas coloreadas. Tienen la
propiedad de colorear juntas o separadamente diversas estructuras. Ejemplo: Giemsa, rojo
neutro, safranina.
d) indiferentes: son insolubles en agua, pero se solubilizan en alcohol o en grasas. No forman
sales. Ejemplo: rojo escarlata, Sudanes.

Acidófilia y Basofilia
La célula, es una estructura heterogénea compuesta por diferentes organoides, tales como
núcleo, mitocondrias, ribosomas, retículo endoplásmico rugoso, etc, todos ellos con una
composición química definida.

La variabilidad en la apetencia tintorial por parte de las células, estará determinada por la
predominancia de determinados organoides o componentes químicos, lo que influirá en el pH
interno que dicha célula presente.

ACIDOFILIA

Los colorantes ácidos o aniónicos tienen carga eléctrica negativa. A estos también se les
conoce como colorantes citoplasmáticos, pues tiñen al grupo químico, cargado
eléctricamente, localizado en un extremo de la cadena de aminoácidos que integran las
proteínas citoplasmáticas.

Las sustancias que atraen eléctricamente a los colorantes ácidos se denominan “acidófilas” y
químicamente están constituidas por componentes básicos o alcalinos.

Ejemplos de colorantes ácidos: la eosina, la fucsina ácida, el ácido pícrico, el naranja G, la

safranina, el azul de anilina, etc.

En las células con una gran actividad energética, como las células musculares que presentan un
alto contenido en mitocondrias, REL, proteínas básicas, membranas celulares, el citoplasma de
estas células, se tiñen con un colorante ácido, por lo tanto, será acidófilo.

BASOFILIA

Los colorantes básicos o catiónicos poseen una carga eléctrica positiva. Se les denomina
también colorantes nucleares, pues tienen afinidad por estructuras celulares ácidas.

Las sustancias teñidas por colorantes básicos se denominan “basófilos” y están constituidas
por componentes ácidos.

Ejemplos de colorantes básicos: la hematoxilina, el rojo nuclear, el azul de metileno, la tionina,

el azul de toluidina, la fucsina básica.

Los núcleos de las células vivas presentan un alto contenido de ácidos nucleicos (ADN, ARN), lo
que les confiere un pH ácido, por lo tanto, tendrán afinidad por un colorante básico, de modo
que los núcleos serán siempre basófilos, y el citoplasma celular será basófilo, cuando haya un
predominio de organelas ácidas (Ej: RER, ribosomas, proteínas ácidas).
 TÉCNICAS DE RUTINA
Técnica Hematoxilina- Eosina
Tricrómica de Mallory
 Técnicas Especiales
TÉCNICAS CITOQUÍMICAS E HISTOQUÍMICAS

- Los procedimientos histoquímicos y citoquímicos pueden tener su fundamento en:

- La unión específica de un colorante
- Uso de anticuerpos marcados con un colorante fluorescente con un componente
celular en particular
- Actividad enzimática inherente de un elemento constitutivo de la célula.
Las técnicas más usadas son:
A- Reacción para demostrar la presencia de mucopolisacáridos
B- Coloración para fibras elásticas
C- Coloración para lípidos
C- Técnicas para localizar enzimas
D- Reacciones para localizar sustancias inorgánicas.
E- Impregnaciones metálicas

A- Reacción para demostrar la presencia de mucopolisacáridos

➢Reacción de PAS (ácido peryódico-Schiff):
Las sustancias coloreadas con PAS, son moléculas con gran contenido de carbohidratos, tales
como el glucógeno, mucopolisacáridos neutros, glucoproteínas y sialomucinas.
➢Reacción de Azul de Alcian (Alcian Blue):
se usa a diferentes pH y caracteriza a los distintos mucopolisacáridos ácidos, tiñéndolos de
color azul.

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B- Coloración para fibras elásticas: para detectar selectivamente las fibras elásticas, se
utiliza la técnica de orceína.
C- Coloración para lípidos: la técnica más usada para lípidos es la de los Sudanes,
debido a que son liposolubles
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D- Técnicas para localizar enzimas:

Sirven para visualizar sitios donde existe alguna actividad enzimática, de modo que no
se observa una enzima coloreada, sino el producto de reacción coloreado que resultó
de la actividad catalítica de la enzima estudiada (Ej: Fosfatasa ácida y alcalina, ATPasa,
esterasas, y, junto a inmunocitoquímica, la peroxidasa.)

E- Reacciones para localizar sustancias inorgánicas:

Las más usadas son:
Azul de Prusia: para localizar elementos que contienen hierro o depósitos de hierro
dándole una coloración azul brillante.
Von Kossa: para detectar calcio, dándole una coloración negra.

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F- Impregnaciones Metálicas: Los metales más usados son la plata (impregnaciones
argénticas), el oro (impregnaciones áuricas) y el osmio (impregnaciones ósmicas).
Las Impregnaciones argénticas reaccionan con el tejido y le otorga una coloración en la
gama del marrón con un fondo amarillento. Si luego de la impregnación se someten los
cortes a un baño de cloruro de oro, se Produce un cambio en la coloración de Fondo
que pasará a un color sepia (rosado).
Este paso se conoce como virado en oro.
Hay diferentes tipos de impregnaciones Argénticas, tales como: Técnica de Golgi-
Hortega-Laviña,
Doble impregnación argéntica de Del Río Hortega,
Técnica de Cajal, etc.

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Estudios complementarios
- Microscopía electrónica
- Inmunofluorescencia
- Polarización
- Inmunomarcación
- Patología molecular

Microscopio electrónico de transmisión (MET):

Posee un tubo emisor de electrones que luego de atravesar la muestra, se concentran y
proyectan sobre una pantalla fluorescente, donde se efectúa el estudio.
Este mecanismo permite observar la ultraestructura de las organelas celulares, a grandes
aumentos (30.000 a 1.000.000 de aumento) las que no se visualizan con el microscopio óptico.
El límite de resolución del MET es 2 a 10 Å (Å= 10-10 m).
Ej: Patologías glomerulares, membranas basales, mesangio
Imagen con MET de una célula donde se observa lisosomas, núcleo con cromatina laxa y otras
organelas en el citoplasma, también se observan pseudópodos.
.
 Microscopio electrónico de barrido (MEB):

Permite observar la superficie de especímenes gruesos y de organismos enteros, que no

podrían ser estudiados con el MET. En este caso el haz de electrones no atraviesa la muestra
sino que realiza un barrido por toda la superficie del material en estudio, el cual emite
electrones que son captados por un detector e integrados a una pantalla de un monitor de TV,
resultando una imagen tridimensional con alto grado de resolución. El límite de resolución del
MEB es 10 nm (nm = 10-9 m).

Imagen con MEB de un epitelio ciliado en el que se observan las cilias que tapizan la superficie apical del mismo
Inmunocitoquímica /Inmunofluorescencia

- La especificidad de la reacción entre el antígeno y el anticuerpo es el fundamento de la

inmunocitoquímica los anticuerpos pueden purificarse de la sangre y conjugarse
(asociarse) con un colorante fluorescente.
- La fluoresceína, el colorante más utilizado, absorbe la luz ultravioleta y emite luz
verde. Los anticuerpos conjugados con fluoresceína se pueden aplicar a cortes de
tejidos congelados o fijados levemente en portaobjetos de vidrio para localizar un
antígeno en células y tejidos. La reacción del anticuerpo con el antígeno puede
entonces examinarse y fotografiarse con un microscopio de fluorescencia.
- En la inmunocitoquímica se utilizan dos tipos de anticuerpos: anticuerpos policlonales
producidos por animales inmunizados y anticuerpos monoclonales producidos por
líneas celulares inmortalizadas (duplicación continua).

Características

 Tejido sin fijación.

 Usa coloración Fluorescentes degradable.
 Debe registrarse microfotográficamente.
 Forma un trípode diagnóstico para las enfermedades glomerulares junto a biopsia con
coloraciones especiales y ME.
Inmunomarcación
• Es una técnica de histología, biología celular y molecular que se en el uso de anticuerpos para
detectar una proteína específica en una muestra

• Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales unidos a una enzima (peroxidasa)
que se une al antígeno.
• Se visualiza con microscopía óptica mediante la coloración del núcleo o citoplasma celular.
Uso
Para diagnosticar enfermedades como el cáncer.
También para distinguir entre diferentes tipos de cáncer.
Identificar origen de tejidos indiferenciados.

Polarización
Los constituyentes de las células y de los tejidos que poseen estructura cristalina -o fibrosa-
presentan una fuerte orientación de sus componentes moleculares.
Si se hace incidir un rayo de luz polarizada sobre un objeto que posea esas características de
orientación de sus componentes moleculares, la luz polarizada actúa como si se dividiera en
dos rayos polarizados, en planos perpendiculares entre sí, y esos dos rayos poseen diferente
velocidad.
Se dice que dichos objetos son "birrefringentes a la luz polarizada", es decir cuando se
examinan con un microscopio dotado con filtros de luz adecuados (un filtro analizador y un
filtro polarizador) dichos objetos brillan, bajo la luz del microscopio.

Ejemplos:

Epitelial: Citoqueratinas 7 y
20
Mesenquimático: Vimentina,
Desmina.
Linfoide: Antígeno común
linfocitario.
SNC: S100
HMB 45: Melanoma
 Imagen de lesión endometrial con Lesión serosa endometrial con HE
HE y Proteína PTEN reactiva y p53 reactiva

Patología Molecular
• Permite conocer el mecanismo por el cual se origina una neoplasia.
• Aporta información de valor pronóstico y sobre la respuesta terapéutica.
• Ej.: Técnica de Hibridación in situ (HIS), microarrays, PCR.

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