UJED FAMEN HISTOLOGIA 1 D

TECNICA HISTOLOGICA Y SUS PASOS

Se define tcnica histolgica al conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada, a fin de posibilitar su estudio al microscopio. El examen al microscopio se hace generalmente por luz transmitida, lo que significa que la luz debe "atravesar" el objeto a examinar para llegar, despus de haber pasado por las distintas lentes del aparato, a impresionar a nuestro rgano visual. Por esa causa, debe ser reducido a lminas muy delgadas y transparentes, las cuales lograremos efectuando una serie de operaciones que sern descriptas ms adelante. OBTENCIN DE LA PIEZA El material a utilizar puede ser extrado de los diversos animales de laboratorio, o bien puede tratarse de material humano. Entre los animales de observacin se eligen aquellos que por su semejanza con el ser humano pueden sustituirlo sin grandes diferencias, y cuya obtencin y crianza puede ser fcilmente efectuada en el laboratorio. Fases en la obtencin de material animal: - Muerte del animal: podemos producirla valindonos de un traumatismo brusco, o por la intoxicacin a causa de una dosis exagerada de narctico. - Extraccin de los rganos: conociendo la anatoma del animal, debemos dirigirnos directamente a los rganos que nos interesan estudiar. En el caso de que estos sean varios, es conveniente extraer primero los que ms fcilmente se descomponen, estos son el pncreas y la porcin inferior del tubo digestivo. - Reduccin a piezas: teniendo en cuenta que para el tamao de las piezas debemos considerar muy especialmente las cualidades del fijador a usar, hablaremos de este asunto cuando tratemos la fijacin.

Reduccin de la pieza Obtencin de material humano: El hombre no es sujeto de experimentacin, esta verdad indiscutible hace que slo en casos excepcionales se pueda obtener material humano en condiciones de ser estudiado histolgicamente. De tres fuentes puede provenir el material humano: las necropsias, las biopsias y las piezas operadas. De stas, slo la primera puede darnos material normal; las dos ltimas proporcionarn tejidos patolgicos. - Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadver. Para histologa normal es necesario que se trate de un cadver fresco y que no haya sido atacado por ninguna lesin, por lo menos el rgano que se quiere estudiar. - Biopsias: son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnstico histopatolgico. - Piezas operadas: los tejidos que han sido extrados de las intervenciones quirrgicas, generalmente tumores u rganos inflamados, tambin pueden darnos material de investigacin pero, como en el caso anterior, slo servirn para anatoma patolgica.

ABIMAEL ULISES RIVERA HERNANDEZ

UJED FAMEN HISTOLOGIA 1 D

FIJACIN La fijacin tiene por objeto matar las clulas y conservarlas, hasta donde sea posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un mtodo histolgico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfolgica y qumica de las clulas y tejidos al estado vivo y que permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloracin o de identificacin que facilitan el completo conocimiento de su constitucin ntima.

Fijacin de la muestra. Se llaman fijadores a las sustancias qumicas o a los agentes fsicos que se utilizan para tal fin. Cualidades que debe tener un fijador: 1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las clulas antes de que aparezcan los fenmenos agnicos o post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.). 2. Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar. 3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo. 4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observacin ulterior (ejecucin de cortes, coloracin, etc.). 5. Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante la fijacin o despus de ella. 6. No provocar o impedir la produccin de estructuras artificiales. 7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos. Manera de actuar de los fijadores Vara con la composicin o naturaleza de los mismos: coagulando las protenas sin combinarse con ellas (alcohol, cido pcrico, yodo, calor), formando combinaciones qumicas con las sustancias orgnicas (cido crmico y sus sales), o reducindose en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (cido smico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro). La mayor parte de los fijadores actan como oxidantes, favoreciendo as la coloracin ulterior de los tejidos (recurdese que stos, en su mayora, son reductores que muchos colorantes se transforman en leucobases incoloras al combinar una molcula de hidrgeno con su cromforo). Fijadores qumicos Son los ms utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola sustancia qumica, y fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su constitucin. FIJADORES SIMPLES: a) Formol al 10%, es el ms usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar rganos o tejidos para estudios histolgicos topogrficos. b) Alcohol etlico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microqumica. c) Alcohol metlico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, mdula sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin, etc.). d) cido smico al 1 2%, es poco penetrante pero enrgico, conserva muy bien estructuras celulares. e) Bicromato de potasio al 3-5%.

ABIMAEL ULISES RIVERA HERNANDEZ

UJED FAMEN HISTOLOGIA 1 D

FIJADORES COMPUESTOS: En su composicin intervienen un nmero variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la accin de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. a) Lquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-actica. b) Lquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-actica. c) Lquido de Helly, mezcla Zenker-formol. d) Lquido de Bouin, mezcla picro-formos-actica. e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohlico. FIJADORES FSICOS: 1. Desecacin. 2. Calor seco. 3. Calor hmedo. 4. Fro. 5. Congelacin y desecacin. DESHIDRATACIN E INCLUSIN EN PARAFINA Deshidratacin Las piezas al ser retiradas del fijador, o despus de haberlas lavado, estn embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergindolos en lquidos anhidros, vidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratacin brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etlico de graduacin creciente.

Se dispone una lmina en un cassette de deshidratacin.

ABIMAEL ULISES RIVERA HERNANDEZ

UJED FAMEN HISTOLOGIA 1 D

Deshidratacin en alcoholes sucesivos. Impregnacin por un disolvente de la parafina (aclaracin) Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o toluol (este ltimo es el que nosotros utilizamos). Al agregar el toluol, no debe aparecer ninguna turbidez. Si se pone blanco-lechoso es que la deshidratacin no ha sido bien lograda y debemos repetir el bao de alcohol absoluto cerciorndonos que realmente lo sea: una gota de alcohol agregada a unos ml de toluol no debe enturbiarlo. Penetracin de la parafina Se sumergen las piezas en parafina (56-58 de punto de fusin), mantenida lquida en la estufa a no ms de 62C. Despus de 1 a 2 horas se renueva la parafina.

Penetracin de la parafina a 56-58C. Inclusin definitiva o formacin del bloque En moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusin de la que ha servido para la penetracin. Se colocan las piezas orientndolas y luego se pone el molde en heladera.

Barras de Leuckart

ABIMAEL ULISES RIVERA HERNANDEZ

UJED FAMEN HISTOLOGIA 1 D

A los 15-30 minutos la parafina se habr solidificado completamente, recortamos los bloques en forma de pirmide cuadrangular truncada, lo adherimos a un taquito de madera mediante una esptula calentada con la llama de un mechero y ya podemos realizar los cortes con el micrtomo.

Factura del taco para cortar. OBTENCIN DE CORTES El objeto de la inclusin que hemos descripto anteriormente es hacer posible la reduccin del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrtomos son instrumentos de gran precisin que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes ms corrientes son los de 4-6 micrones. Consideraremos cuatro tipos de micrtomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el de congelacin, y el cristato o critomo. - Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza por unas guas especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos. - Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta a una platina, sta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de cinta.

Corte en micrtomo tipo Minot. - Tipo congelacin: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en lugar de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el aparato se caracteriza por tener un sistema de congelacin colocado debajo de la platina que utiliza la expansin brusca del anhdrido carbnico contenido en un cilindro con el cual se comunica. - Cristato: consta de un micrtomo tipo Minot incluido en una cmara de congelacin. El volante de inercia que controla la realizacin del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance estn situados dentro de la cmara fra (normalmente a -20 C). Pese a la disposicin horizontal de la cuchilla, la obtencin de secciones seriadas es posible gracias a la existencia de un sistema anti-enrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla. En los modelos ms modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, as como enfriar rpidamente la muestra a -60 C gracias a la existencia de una placa de congelacin instantnea. Frente al micrtomo convencional de congelacin, el cristato posee la gran ventaja de permitir la obtencin de cortes mucho ms delgados (por lo general de 4 m y, en manos experimentadas, hasta 2 m).

ABIMAEL ULISES RIVERA HERNANDEZ

UJED FAMEN HISTOLOGIA 1 D

Los cortes de parafina se extienden, al obtenerlos del micrtomo, en agua tibia contenida en un cristalizador. En ese mismo agua se introducen portaobjetos, previamente desengrasados, cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer y, con la ayuda de una aguja histolgica, se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a continuacin se lo levanta. COLORACIN Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloracin. Colorantes: reciben esta denominacin las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos. Coloracin: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solucin colorante. Clasificacin de los colorantes: Segn su origen se clasifican en: COLORANTES NATURALES: - Animales (carmn) - Vegetales (hematoxilina, orcena, azafrn) COLORANTES ARTIFICIALES O SINTTICOS (COLORES DE ANILINA): - cidos: sales cuya base es incolora y su cido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmticos. - Bsicos: sales cuya base es coloreada y el cido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares. - Neutros: sales en las que tanto el cido como la base son coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. - Indiferentes: no forman sales. Tien aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del lquido que ha servido para preparar la solucin colorante (Sudn lll, rojo escarlata). Por otro lado, las coloraciones pueden ser: - Ortocromticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solucin colorante empleada. - Metacromticas: una sustancia o un componente celular se tie con un color diferente al del colorante empleado. Mtodos de coloracin: - Coloracin directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el objeto. - Coloracin indirecta: requiere la intervencin de intermediarios o mordientes para que la coloracin tenga lugar. - Coloracin progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto ptimo. - Coloracin regresiva: se realiza primero una sobrecoloracin y luego se elimina el resto del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina diferenciacin. - Coloracin simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado (ncleo, fibras elsticas, etc.). - Coloracin combinada: se tien los elementos nucleares y citoplasmticos recurrindose, generalmente, al empleo sucesivo de colores bsicos y cidos que contrastan por sus colores. - Coloracin panptica: es una coloracin combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros (May-GrnwaldGiemsa). - Coloracin pancrmica: en un solo bao colorante actan todos los colorantes neutros que se necesiten. Colorantes ms utilizados en histologa humana: HEMATOXILINA: - Es un colorante vegetal. - Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposicin) u oxidantes artificiales (xido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potsico, etc.) - Es un colorante directo, pero en la prctica se lo utiliza en forma de lacas hematoxilnicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solucin colorante), comportndose en este caso como un colorante indirecto.

ABIMAEL ULISES RIVERA HERNANDEZ

UJED FAMEN HISTOLOGIA 1 D

EOSINA: - Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixantnicos halogenados con tres grupos arilo). - Presenta autofluorescencia espontnea. - Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohlicas. Para colorear se emplea generalmente una batera de coloracin.

Batera de Coloracin H&E. MONTAJE Luego de la coloracin, se deshidrata el corte y se procede a la aclaracin y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro. La deshidratacin se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes. La aclaracin se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es impregnar el corte con un disolvente del Blsamo de Canad, que al mismo tiempo le confiere un ndice de refraccin semejante al del vidrio. Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el mismo una gota de Blsamo de Canad disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto. Se deja secar unas horas antes de su observacin al microscopio. PROTOCOLO GENERAL A continuacin se presenta el protocolo de trabajo utilizado por nuestra ctedra para la tcnica de Hematoxilina - Eosna para preparados de uso didctico: I. Fijacin En formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos durante 6 hs. II. Corte Se le da el tamao deseado a la pieza y se la coloca en una bolsa de gasa, con el fin de enjuagarla en agua corriente durante, por lo menos, 15'. III. Deshidratacin 1) 2) 3) 4) 5) Alcohol 70, 1h30'. Alcohol 96, 1h30'. Alcohol 100 (l), 1h30'. Alcohol 100 (ll), 1h30'. Toluol, entre 1h30' y 3hs.

ABIMAEL ULISES RIVERA HERNANDEZ

UJED FAMEN HISTOLOGIA 1 D

IV. Inclusin 1) 2) 3) 4) 5) 6) Secado de la muestra con gasa. Parafina 56 (l), 1h30'. Parafina 56 (ll), 1h30'. Formacin de la barra. 30' de frezzer. Fractura del taco

V. Corte VI. Coloracin 1) Secado de los cortes en estufa a 58C, 15'. 2) Xilol o toluol (I), 15' en estufa. 3) Xilol o toluol (II), 2'. 4) Alcohol 100, 30". 5) Alcohol 96, 30". 6) Alcohol 70, 30". 7) Alcohol 50, 30". 8) Agua destilada, 30". 9) Hematoxilina, 130". 10) Agua corriente, 2. 11) Alcohol 50, 15". 12) Eosina, 30". 13) Alcohol 96, 10". 14) Alcohol 100, 10". 15) Xilol, 1 por lo menos. 16) Montaje con Blsamo de Canad sinttico.

ABIMAEL ULISES RIVERA HERNANDEZ