Pruebas bioquímicas

1) Prueba Agar hierro de Kligler (KIA)

Medio diseñado para la identificación de enterobacterias y otras bacterias Gram negativas

Medios Sustratos Metabolismo Productos Indicador

Agar Hierro de Glucosa 0,1%, lactosa Fermentación Ácidos mixtos y H2S Rojo de fenol
Kligler 1%

NO FERMENTADORAS . Las bacterias incapaces de fermentar glucosa u otros carbohidratos, utilizará las peptonas y
liberan aminas que alcalinizan todo el medio.
La punta vira de color rojo y el fondo quedará rojo o sin cambio es decir pH neutro, tubo completamente rojo.
Interpretación: K/K (punta alcalina/fondo alcalino o neutro)
TUBO D , el microorganismo no es de la familia Enterobacteriaceae.
NO FERMENTADORAS DE LACTOSA. Las bacterias que solo fermentan la glucosa, no sacarosa ni lactosa. La bacteria es
consumirá toda la glucosa las 6-8 horas, lo que acidificará la punta, virará completamente amarillo. Al agotarse la
glucosa (baja concentración) y no poder fermentar lactosa o sacarosa empezará a metabolizar proteínas.
Para metabolizar proteínas la reacción requiere oxígeno, las aminas producidas por el metabolismo de las peptonas,
causarán un descenso en el pH (alcalino) y virará de amarillo a rojo en la punta.
Interpretación: K/A (punta alcalina /fondo acido)
TUBO B.
FERMENTADORAS DE LACTOSA. Las bacterias fermentadoras de glucosa y lactosa, fermentan primero la glucosa 0.1% y
al terminarse utilizan la lactosa 1%, el piruvato se metaboliza y forma ácidos por el Ciclo de Krebs las 8 a 12 horas todo el
medio se verá amarillo.
Si la bacteria puede metabolizar lactosa seguirá procuciendo productos ácidos, y a las 18-24 horas todo el tubo seguirá
amarillo.
NOTA:para utilizar glucosa puede ocurrir de dos formas, aerobia (superficie del tubo) y anaerobia (el el fondo del tubo)
Interpretación: A/A (punta acida/fondo ácido)
TUBO A
Composición del medio

El medio contiene sales de hierro, por lo que también pone de manifiesto la producción de H 2S por la formación de un
precipitado negro de sulfuro ferroso. (TUBO C , tubo oscuro)

Medio Agar Hierro de Kliger (en pico de flauta), medio diferencial.

 Peptona de carne 13.0 g
 Tripteína 10.0g
 Lactosa 10.0 g
 Glucosa 1.0 g
 Cloruro de sodio 5 g
 Citrato de hierro y amonio 0.5 g
 Tiosulfato de sodio 0.3 g
 Rojo de fenol 0.025 g
 Agar 15 g (medio sólido)
 pH 7,3 ± 0,2

Tubo C 1 2 3 4 4A 5
Fermentación de
glucosa
- - + + + + +
Producción de Gas
por la fermentación
- - - ± + + ±
Fermentación de
Lactosa
- - - - + + +
Producción de H2S
- - - + - - +

2) Medio SIM, Sulfhídrico indol movilidad

Con este medio se realizan 3 pruebas:

1. Producción de H2S
2. Producción de indol
3. Movilidad

Componsición del medio:

1. Producción de H2S

El objetivo de la prueba es detectar la presencia de las enzimas cisteín desulfurasa y tiosulfato reductasa.
En presencia de tiosulfato (Na2S2O3) en el medio o la degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados,
algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa.
El gas incoloro H2S reacciona con el Na2S2O3 reacciona con este para producir un precipitado negro insoluble de
sulfuro ferroso metálico (FeS).

Prueba Prueba
positiva negativa

2. Producción del indol

Prueba Prueba
positiva negativa
Revelado con el reactivo de Erhlich o kovacs.

Las enzimas triptofanasas oxidan el triptófano para formar tres metabolitos: indol,
metil indol y ácido indolacético. Los reactivos de Erhlich o Kovacs contienen DMABA
(dimetilaminobenzaldehido) que reacciona con el indol el cual es incoloro y produce
un compuesto quinónico color rojo, que se observa por la aparición de un anillo en la
superficie del medio. (Revelado).

3.Movilidad

El medio es semisólido (agar-agar al 0.3%), por lo tanto nos permite determinar si el

microorganismo es capaz de desplazarse, más allá de la zona de inoculación (picadura) mediante la utilización de
flagelos. Los microorganismos inmóviles solo crecerán en la zona inoculada.
Prueba Prueba Prueba
positiva negativa positiva

Inoculación del medio: El medio es semisólido, debe ser inoculado mediante una picadura empleando un asa recta
(en forma de aguja), llegando casi al fondo del tubo. La inoculación es un paso clave, si no se inocula correctamente,
podemos tener resultados dudosos o difíciles de interpretar.
 Incubación: el medio inoculado se incuba a 37 °C, durante 24- 48 horas

Interpretación de resultados:

Medio sin Sulfhídrico: + Sulfhídrico: - Sulfhídrico: + Sulfhídrico: -

inocular Indol: + Indol: + Indol: - Indol: -
Movilidad: + Movilidad: - Movilidad: + Movilidad: inconcluso

3) Rojo de metilo-Voges Prokauer RMVP

El objetivo de la prueba es determinar si el microorganismo fermenta la glucosa por la vía ácido mixta (ácida) o la
butilenglicólica (neutra).

Composición del caldo PMVP

Fermentación ácido-mixta /Prueba Rojo de Metilo

En esta vía de fermentación se producen ácidos láctico, fórmico, succínico y acético que ocasionan una gran acidez en el
medio (pH<4.4 vire color rojo). Estos microorganismos por cada 4 moléculas de piruvato formadas, reducen dos a ácido
láctico y dos las metabolizan para formar ácido acético y fórmico; parte del ácido acético pasa a etanol y parte del
fórmico a CO2 y H2 en cantidades iguales.
Fermentación Butilenglicólica/ Prueba de Voges-Proskauer

piruvato

El piruvato se metaboliza produciendo cantidades menores de ácido láctico, fórmico y acético, la mayor parte del
piruvato se condensa formando acetilmetilcarbinol o acetoína, que es reducido a 2,3-butilenglicol, ambos productos son
neutros productos que son neutros.

Para determinar la presencia de los productos neutros sen agrega un poco de α-naftol al 5% en etanol (medio adquiere
aspecto lechoso), luego se le añade (KOH 40%) que desaparece el aspecto lechoso, se agita fuertemente. El KOH y el α-
naftol oxidan a la acetoína en presencia de oxígeno produciendo diacetilo. Este compuesto reacciona con el grupo
guanidino de aminoácidos provenientes de las peptonas que contiene el medio, dando una coloración rosa-roja dando
una coloración color rosado - rojo en la parte superior del tubo (prueba positiva).

Revelación con KOH y α-naftol

Inoculación del medio: para esta prueba, se inoculan dos tubos de caldo RMVP. Al ser un medio líquido, cada tubo se
inocula con 2 asadas de la suspensión del microorganismo de interés.

Incubación: se incuban a 37°C/48 h y uno de ellos se utiliza para la prueba del rojo de metilo y el otro para la de Voges-
Proskauer.

Interpretación de resultados

Rojo de metilo

Voges-Proskauer

+ - - +

4) Prueba de citrato
El objetivo de la prueba es determinar si el microorganismo puede utilizar el citrato como única fuente de carbono.
La prueba del citrato forma parte de la serie IMViC (Indol, rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato) que distingue
entre los miembros de la familia de las enterobacterias y las diferencias de otros bacilos Gram negativos.

Composición del medio Agar Citrato de Simmons

Prueba de reducción de nitratos

 En presencia de la enzima citrato permeasa, el citrato entra a la célula y es convertido a piruvato en el ciclo de
Krebs. El citrato funciona como la única fuente de C y las sales de amonio del medio serán la fuente de N para que le
microrganismo siga creciendo. Entonces, utiliza el fosfato monoamónico:

La extracción de nitrógeno de las sales de amonio produce amoniaco

que reacciona con el agua formando el hidróxido de amonio y alcaliniza
el medio virando el indicador al alcalino.

Rango de vire del azul de bromotimol: vira de verde en pH neutro. y azul en pH alcalino.

Inoculación del medio: se inocula por estría recta a partir de una suspensión del microorganismo.

Incubación:18-24 horas.
Interpretación de resultados:
POSITIVO NEGATIVO
El microorganismo posee la El microorganismo no tiene la
enzima citrato permeasa, por lo enzima citrato permeasa, por lo
tanto, utiliza el citrato como que no crecerá en el medio cuya
fuente de C y las sales de amonio única fuente de C es el citrato,
como fuente de N. Virará en azul no usará las sales de amonio y el
por el medio alcalino (pH >7). pH se mantendrá neutro y virará
a verde.

Ejemplos:

Medio sin inocular La coloración amarilla se debe a la

pH neutro deshidratación del medio en el pico de la flauta.

5) Prueba de Hugh y Leifson (OF) Oxidación-Fermentación

Fue diseñada por Hugh y Leifson en 1953 con el fin de diferenciar el metabolismo de bacterias Gram negativas como
Pseudomonas sp., Salmonella sp., Shigella sp. y Alcaligenes sp. que producen ácidos en forma escasa.
El objetivo de la prueba es determinar sí la bacteria en estudio metaboliza los carbohidratos de manera fermentativa
u oxidativa.
 En los organismos Quimiorganótrofos se conocen dos mecanismos de conservación de energía: Fermentación y respiración en
ambos casos el resultado es el mismo la síntesis de ATP.

RESPIRACIÓN: El proceso REDOX ocurre en presencia de aceptores finales de electrones, por fosforilación oxidativa, estos
aceptores pueden ser:

a) Oxígeno: Respiración aerobia

b) Sustancias orgánicas ó inorgánicas diferentes al oxígeno: Respiración anaerobia

FERMENTACIÓN: El proceso REDOX ocurre sin la presencia de aceptores finales de electrones, por fosforilación a nivel de
sustrato, es decir la fermentación no requiere oxígeno.

Veamos ahora la diferencia entre ambos procesos de obtención de energía:

Fosforilación oxidativa (Respiración): En éste proceso, la membrana se “activa” con los electrones que provienen de la sustancia
que está siendo utilizada como fuente de energía y transportados en la cadena respiratoria en el interior de la membrana y los
protones bombeados al exterior, creando una diferencia de potencial, por quimiósmosis utilizada por la ATPasa para fosforilar el
ADP en ATP, finalmente los electrones son aceptados por el oxígeno en el caso de la respiración aerobia y los productos finales
son: ATP,CO2 y agua.

Fosforilación a nivel de sustrato (Fermentación): En este proceso, la fuente de energía se transforma químicamente,
fosforilándose y desfosforilandose de tal manera que se obtiene energía directamente de éstas reacciones y se almacena en el
ATP. Un ejemplo de esta manera de obtener energía es la Glucólisis, la cual no requiere O 2. El piruvato puede ser transformado
en productos reducidos de la fermentación para usar el NADH que se transforma en NAD y vuelve a ser utilizado en la reducción
del Gliceraldehído 3 fosfato. Ejemplos de estos productos reducidos de la fermentación son: los ácidos láctico, acético,
propiónio, succínico, fórmico, etanol, etc. y su producción depende de las enzimas que codifique el microrganismo.

La prueba OF nos proporciona datos sobre el tipo de metabolismo que realiza una bacteria para obtener energía a
partir de algún carbohidrato.
a) Degradación oxidativa: en presencia de O2, respiración aerobia.
b) Degradación por fosforilación a nivel sustrato: fermentación.
Composición del medio OF
Tiene características especiales en cuanto a su composición que permiten detectar pequeñas cantidades de ácidos
producidos tanto por la vía fermentativa como por la oxidativa, contiene una menor cantidad de peptonas y mayor
concentración de carbohidratos, de esta manera se disminuyen las sustancias que provocan la alcalinización del medio
producto de la degradación de las proteínas y aumenta la producción de ácidos por la utilización de los carbohidratos.

Preparación del medio

1. Se deben disolver los componentes excepto el carbohidrato que se deseé probar, y se e
2. Esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 min.
3. Posteriormente, se añade el carbohidrato esterilizado por filtración a la base
 4. Se distribuye en tubos estériles con tapón de rosca en condiciones de esterilidad.
 Sí los tubos son almacenados por períodos largos, deben ser sometidos a ebullición durante 10 min. y enfriados
antes de utilizarlos. Se requiere de glicerol estéril.
Inoculación del medio: para cada microorganismo se utilizan dos
tubos. Se toma el inóculo con un asa recta y se punciona el
centro de cada tubo sin llegar al fondo. A uno de los tubos se le
agrega en área aséptica una capa de aproximadamente 5mm
(1,2 mL) de glicerol estéril, esto para impedir la entrada de O 2.

Incubación (ambos tubos): a 37ºC y se observan cada 24h,

durante 3 o 4 días.

Interpretación de resultados:

Resultado Tubo abierto Tubo sellado Tubo abierto, sin glicerol: El O2 se encuentra en el medio, las
Sin glicerol Con glicerol bacterias aeróbicas crecerán en la superficie del medio y oxidará
Oxidación glucosa en CO2, este reaccionará con el agua y formara ácido
carbónico, acidificará la superficie y el indicador azul de bromotimol
virara a amarillo. Después de 24 h de incubación todo el tubo virará
todo el tubo amarillo.

Tubo sellado, con glicerol: no permite el paso de O2 y las bacterias

no podrán usar el carbohidrato, no hay acidez ni vire del indicador.

Resultado Tubo abierto Tubo sellado

Tubo abierto, sin glicerol: hay presencia de O2 en el medio, Sin glicerol Con glicerol
las bacterias no usarán el carbohidrato y no se producirá Fermentació
acidez, el indicador no vira, quedando color verde o n
ligeramente azul, esto indica el uso de peptonas (medio
ligeramente alcalino).

Tubo sellado, con glicerol: no hay presencia de O2, por lo

tanto, fermenta el carbohidrato produciendo acidez y
vira de color amarillo.

Resultado Tubo abierto Tubo sellado En ambos tubos hay vire del indicador a amarillo, lo que
Sin glicerol Con glicerol indica que la bacteria oxida y fermenta el carbohidrato, a
Oxidación y estos microorganismos se les llama facultativos.
Fermentación
 Resultado Tubo abierto Tubo sellado
En este caso el microorganismo no tiene capacidad Sin glicerol Con glicerol
para utilizar el carbohidrato añadido como fuente de Ni fermentación, ni
carbono y energía, pues posiblemente carezca de los oxidación
mecanismos de transporte necesarios para (No sacarolítico)
introducirlo al citosol.

6) Fermentación de carbohidratos.
El objetivo de la prueba es determinar si el microorganismo posee la habilidad de fermentar algunos carbohidratos.

Carbohidratos

a) Monosacáridos: Glucosa, fructosa, galactosa, entre otros.

b) Disacáridos: Lactosa (Glucosa + Galactosa), Sacarosa (Glucosa + Fructosa),Maltosa (Glucosa + Glucosa)
c) Alcoholes producto de la reducción de un monosacárido: Manitol, sorbitol, etc.

Los polisacáridos, trisacáridos, disacáridos son demasiado complejos para penetrar en una célula bacteriana para su degradación. Si
pueden ser metabolizados por una especie bacteriana particular, primero son catabolizados a monosacáridos menos complejos por
enzimas exocelulares (permeasas) para que puedan ser incorporados al interior de la célula.

Fermentación: proceso anaeróbico de oxidación-reducción, en donde un sustrato orgánico actúa como el aceptor final de hidrógeno
(aceptor de electrones) en lugar del oxígeno. La fermentación de sustratos orgánicos como los carbohidratos da por resultado
productos finales reducidos y oxidados. Los productos finales dependen de varios factores como: el microorganismo que lleva a cabo
la fermentación, el sustrato a ser fermentado y en ocasiones de factores ambientales.

Las bacterias que fermentan un carbohidrato por lo común son anaerobias facultativas. No todos los monosacáridos son degradados
por todas las especies bacterianas, lo que ayuda a la identificación en grupos, géneros o especies. Las bacterias también difieren en
las vías metabólicas utilizadas para fermentar el mismo sustrato, lo que da por
resultado distintos productos finales, los que dependen del sistema enzimático
presente en la especie y de las condiciones ambientales. Un importante es que
antes de su degradación la glucosa es fosforilada a un compuesto 6-fosfato.

La principal vía fermentativa de degradación de la glucosa es la vía de Embden-

Meyerhof-Parnas (EMP), aunque la degradación puede ocurrir por vía o en
combinación con shunt (desviación) de la pentosa (vía de Warburg-Dickins, shunt
de monofosfato de hexosa (HMP) o vía de EntnerDoudoroff (ED). Sin embargo, las
tres vías requieren la fosforilación inicial de la glucosa antes de que pueda ocurrir
la degradación.
 Glucólisis (Proceso Anaeróbico)

Etapa 1 :La glu se fosforila a expensas del ATP; una vez fosforilada se
rompe para formar gliceraldehído 3-fosfato.

Etapa 2 (Vía EMP): El gliceraldehído 3-fosfato es convertido en

piruvato por oxidación del agente oxidante (NAD). En esta etapa se
producen, en total 8 moléculas de ATP. Por cada molécula de glu se
producen 2 de piruvato.

Rutas posibles del piruvato (fermentación):

Indicadores ácido-base

Rojo de fenol
pH < 6.6 el indicador vira a color amarillo

pH 6.7 – 7.2 vire anaranjado

pH > 7.3 el indicador vira a color rosa

Azul de bromotimol
pH ácido el indicador vira a color amarillo

pH neutro el indicador es verde

pH básico el indicador vira a azul

Púrpura de bromocresol
pH ácido el indicador vira a color amarillo

pH neutro el indicador es violeta

pH básico el indicador vira a color púrpura intenso

Composición del caldo con carbohidrato fermentable e indicador ácido-base

Inoculacion del medio: Inocular 2 asadas de una suspensión del cultivo axénico en el caldo. Después adicionar aceite
mineral (para medio sin O2).

Incubación: a 37° C durante 24 a 48 horas.

Interpretación de resultados

El microorganismo fermenta el carbohidrato si el medio de cultivo(caldo) si el indicador vira a un pH ácido(prueba

positiva). Si el indicador vira a un pH neutro o básico se considera que el microrganismo no fermenta el
carbohidrato(prueba negativa). Hay que observar si hay producción de CO 2 en la campana de fermentación por
desplazamiento del medio(burbujas).

Fermentación de carbohidratos
Indicador ácido- base: Rojo de Indicador ácido- base: Púrpura de Indicador ácido- base: Azul de
fenol bromocresol bromotimol

+ - + -

7) Reducción de nitratos
El objetivo de la prueba es determinar si el microorganismo reduce nitratos. Es decir, si presenta la enzima nitrato
reductasa y las enzimas que catalizan la reducción el nitrito a nitrógeno molecular:

Composición del caldo nitratos

Inoculación del medio: El caldo nitratos se presenta en tubo de 13 x 100 mm con campana de Durham, se inocula con 2
asadas de una suspensión del microorganismo de interés.

Incubación del medio: a 37°C por 48 h.

Interpretación de resultados:

I. La formación del compuesto colorido (p-sulfobencenoazo-α-naftilamina) indica la presencia de nitrito. Es decir,

que el microorganismo tiene la enzima nitrato reductasa: prueba positiva.
II. Si no se forma el compuesto rojo:
a) El microorganismo no tiene la enzima nitrato
reductasa, se utiliza la prueba del zinc (agente
reductor) para reducir químicamente los nitratos
presentes a nitritos y formar con los reactivos de
Griess el compuesto colorido. Si se forma el
compuesto rojo al agregar Zn, el microorganismo NO
reduce el nitrato, lo reduce el Zn: prueba negativa.

b) El
microorganismo tiene la enzima nitrito reductasa y
otras enzimas que catalizan su reducción hasta nitrógeno molecular (N 2). El Zn no encontrará nitrato que
reducir, no habrá formación de nitritos y la prueba se mantiene sin coloración: prueba positiva. El N2 (g) se
detecta en la campana de Durham.

Sin inocular 1.Sin inocular 2.Con Griess A y B 3.Prueba con Zn

 + + + -
8) Hidrolisis de urea
El objetivo de la prueba es evidenciar si el microorganismo posee la enzima ureasa que cataliza la de hidrólisis de la
urea.

La catálisis de la hidrólisis de la urea por la enzima ureasa libera amoniaco y ácido carbámico, el ultimo es inestable y se
descompone en NH3 y CO2.El amoniaco alcaliniza el medio y el indicador rojo de fenol dará una prueba positiva en color
bugambilia.

Composición del caldo urea:

Inoculación del medio: Inocular 2 asadas de una suspensión homogénea del cultivo axénico del microorganismo en el
caldo urea.

Incubación: a 37°C/24 a 48 horas. El período de incubación puede variar. Existen microorganismos que metabolizan la
urea rápidamente y otras que lo hacen lentamente. El período de incubación puede ser de hasta 6 días.

Interpretación de resultados

Medio sin inocular Ureasa – puede virar naranja Ureasa +

o amarillo Escherichia coli
 Proteus vulgaris Serratia marcescens
Proteus mirabilis Salmonella sp.
Kliebsiella pneumoniae

9) Lisina Hierro Agar (LIA)

El objetivo de la prueba es determinar la descarboxilación o desaminación de la lisina y la producción de ácido
sulfhídrico y gas.

Composición del caldo urea:

El medio es preparado en tubos inclinados, en el fondo se llevarán a cabo las reacciones anaeróbicas
(descarboxilación)mientras que en el pico de flauta las reacciones aeróbicas (desaminación).

Inoculación del medio: Se inocula por picadura en el fondo y por estría recta u ondulada en el pico de flauta

Incubación: a 37ºC de 18 a 24h

Interpretación de resultados

DESCARBOXILACIÓN DE LA L- LISINA

Sí el microorganismo cuenta con la información para codificar

la enzima Lisina Descarboxilasa; la acidez ocasionada por la
fermentación de la glucosa inducirá la producción de la
enzima. Por el pH ácido solo el fondo del tubo a amarillo, pero
la subsecuente descarboxilación de la Lisina alcalinizará el medio vira a morado por la formación de la diamina
cadaverina.

PRUEBA POSITIVA: el PRUEBA NEGATIVA: el

microorganismo microorganismo fermenta la
fermenta glu y glu, el indicador vira a
posteriormente ocurre la amarillo en el fondo del tubo,
descarboxilación de la pero no se descarboxilasa la
lisina que alcalinizará el L-Lisina (no tiene la enzima),
medio y todo el tubo el fondo permanece amarillo
virará a color morado. y el pico de flauta morado

DESAMINACIÓN DE LA LISINA

Prueba
positiva

Sí el microorganismo es capaz de sintetizar la enzima Lisina Desaminasa, se producirá el ácido alfa-ceto carbónico que
reaccionará con al citrato férrico de amonio del medio produciendo un color rojo púrpura.

Estas reacciones necesitan de oxígeno para llevarse a cabo, por lo solo se detectan el pico de flauta de los tubos.

PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO H2S

Las bacterias que poseen la enzima Tiosulfato reductasa, pueden utilizar el tiosulfato como último aceptor de
electrones en su cadena de respiración anaeróbica para producir ácido sulfhídrico, que al reaccionar con las sales
férricas del medio produce un precipitado negro de Sulfuro de fierro.
Nota: La capacidad de formación de H 2S en éste medio no es muy confiable, debido a que algunas bacterias
descarboxilasa negativas capaces de producir H2S no formarán precipitado negro, se recomienda corroborar con otros
medios que contengan fierro.

Son prueba positivo a formación de gas si se observa el precipitado negro es decir positivo a producción de H 2S.

10) Hidrolisis de hemoglobina.

Enzimas: son catalizadores biológicos de naturaleza proteica y actividad específica.

o Enzimas constitutivas: son sintetizadas de manera constante por los microorganismos y son las responsables de
mantener las funciones vitales de la célula.
o Enzimas inducidas: se producen como respuesta a la presencia de sustratos específicos que actúan como estímulos.

Clasificación por su localización se clasifican en:

a) Endoenzimas: su actividad se lleva a cabo en el interior de la célula interviniendo en los procesos metabólicos del
microorganismo.
b) Exoenzimas: son secretadas por la célula y actúan fuera de ella.
Son INDUCIBLES: el microorganismo solo las sintetiza cuando NO hay más nutrientes en el medio.
Su función principal es disminuir el tamaño de las moléculas complejas que existen en el medio ambiente a través de
reacciones de hidrólisis.
Para poner de manifiesto esta actividad se usan pruebas de hidrólisis de diferentes sustratos.

Hidrolisis de proteínas: las proteínas son convertidas en el exterior de la célula en fragmentos más pequeños.
El objetivo de esta técnica es determinar la capacidad hemolítica del microorganismo (lisis de eritrocitos, degradación de
membrana de glóbulos rojos). La enzima encargada de este proceso es la HEMOLISINA. Las hemolisinas degradan la
membrana de los glóbulos rojos.

Composición del medio Agar Sangre:

 Cloruro de sodio 5g
 Infusión de músculo cardiaco10g
 Peptona 10g
 5 al 10% de sangre de carnero desfibrinada
 Agar 15g

Interpretación de resultados:

β HEMÓLISIS α HEMÓLISIS γ HEMÓLISIS

Hemólisis total Hemólisis parcial No hemólisis
Los glóbulos rojos al hidrolizarse Cuando la hidrólisis de la hemoglobina es parcial se (no hay halo).
totalmente liberan mioglobina produce H2O2 que oxida la mioglobina formando
incolora (halo incoloro). metamioglobina verde (halo color verdoso).

NOTA: Sólo para géneros de estreptococos y enterococos se clasifica la Hemólisis en α, β y γ. Para cualquier otro género
será total, parcial y no Hemolítico.

11) Degradación de Caseína.

Investigar la producción de exoenzimas proteolíticas

Composición del medio Agar Leche Descremada:

Inoculación del medio: el medio se encuentra en cajas de Petri,

se inocula con un asa bacteriológica mediante una estría recta
en la superficie. La caja se puede dividir en 2 o 4 partes para
determinar la hidrólisis de las proteínas en varios
microorganismos a la vez.

Incubación del medio: se incuba a 37 °C, durante 24- 48 horas

Interpretación de resultados:
 Medio Sustrato Enzima Producto
Leche Caseína Caseinasa Péptidos, aminoácidos Las proteasas son excretadas al medio
descremada (Proteasa, individuales.
para la degradación de proteínas, la leche
exoenzima)
descremada contiene la caseína (proteína)
la cual tiene un color blanco, cuando la
caseína es hidrolizada desaparece el color blanco alrededor del crecimiento microbiano. Esta es una proteína y en esta
prueba es uno de los sustratos de las enzimas que queremos detectar.

Prueba Prueba
positiva positiva

Medio sin inocular

Prueba Prueba
negativa positiva

Prueba
+ positiva
Prueba
positiva

+ + Prueba Prueba
positiva
positiva

12) Hidrólisis de gelatina o Licuefacción de la gelatina

El objetivo de la prueba es determinar si un microorganismo posee la habilidad de producir enzimas proteolíticas
(gelatinasas) que den como resultado la licuefacción de la gelatina.

Composición del medio Gelatina nutritiva:

Inoculación del medio: inocular por picadura con asa recta.

Incubación: a 37° C/24 a 48 horas. Refrigerar 30 minutos e Interpretar resultados.

Interpretación de resultados:
La gelatina es una proteína que tiene la capacidad de gelificar, cuando es hidrolizada por la gelatinasa en los
aminoácidos que la componen pierde su característica de gelificar. Se pueden emplear varios medios que permiten la
visualización macroscópica como la gelatina adherida a carbón activado.

Gelatinasa -
Medio sólido
Escherichia coli
Enterobacter aerogenes

Gelatinasa +
Licuefaccíón del medio
+ Proteus vulgaris
Pseudomonas aeruginosa

13) Hidrolisis de DNA

El objetivo de la prueba es determinar si el microorganismo secreta la exoenzima Desoxirribonucleasa (DNAsa) que
hidroliza DNA.

Composición del medio Agar DNA:

Inoculación del medio: Para esta prueba, las placas de agar se dividen en 2, 3 o 4 partes. En cada una
se inocula una estría recta de las suspensiones bacterianas.

Incubación: a 37°C por 24-48 h.

Interpretación de resultados:
Los reveladores ponen en manifiesto la presencia del DNA íntegro, es decir, éstos interactúan únicamente con las
moléculas completas de DNA. De tal manera, la ausencia de interacción del revelador evidencia la hidrólisis de DNA.

A. Interpretación con HCl 6M

El DNA es soluble en medio acuoso debido a los grupos fosfato que contiene (carga negativa). Al agregar HCl, los iones
H+ interactúan con los grupos fosfato, reduciendo las fuerzas repulsivas entre las cadenas, promoviendo el plegamiento
del DNA y, por lo tanto, volviéndolo insoluble.

Si la bacteria secreta DNAsas que hidrolizan el DNA, al adicionar HCl se observa un halo traslúcido alrededor de la
colonia.

B. Interpretación con azul de toluidine

El azul de toluidina o cloruro de tolonio (TBO) es un colorante básico, cargado positivamente. En presencia de DNA,
las cargas positivas del colorante interactúan con sus grupos fosfato, tiñendo al DNA de azul.

Pruebas positivas con azul de toluidina: la presencia de un halo rosado alrededor de la colonia indica que la bacteria
secretó DNAsas que hidrolizaron al DNA, por lo que alrededor del crecimiento bacteriano no hay coloración azul
como en el resto de la caja donde el DNA está intacto.

Prueba positiva

Staphylococcus aureus

C. Interpretación con Verde de Metilo

 Otra manera de hacer esta prueba es inoculando la bacteria en placas de agar DNA con verde de metilo (se adiciona
0.05 g/L de colorante durante la preparación del medio). Al ser también un colorante básico cargado positivamente,
el verde de metilo interactúa con los grupos fosfato del lado externo del DNA, tiñéndolo de un color verde menta.

Cuando el DNA es hidrolizado por la bacteria, el colorante queda libre y, al pH en que se prepara el medio de cultivo,
el verde de metilo es incoloro. La presencia de un halo incoloro o amarillento alrededor de la colonia de la bacteria
indica que el DNA fue hidrolizado (prueba positiva).

14) Hidrólisis de la lecitina

El objetivo de la prueba de hidrólisis de lípidos es entonces determinar si el microorganismo secreta lipasas para
hidrolizar lípidos, como la lecitina de la yema de huevo.

Composición del medio Agar con yema de huevo:

Se agrega una emulsión de yema de huevo a un medio general base como el agar nutritivo, agar cuenta estándar y
agar BHI.

Inoculación del medio: El agar con yema de huevo se inocula con una estría recta a partir de una suspensión del
microorganismo. La caja de Petri se puede dividir en 2, 3 o 4 partes para determinar la hidrólisis de lecitina en varios
microorganismos diferentes a la vez.

Incubación: a 37°C por 48 h.

Interpretación de resultados:

HIDRÓLISIS DE LÍPIDOS: los lípidos, como la lecitina de la yema de huevo, son biomoléculas demasiado grandes que no
penetran las células. Algunos microorganismos secretan lipasas (un tipo de exoenzimas) que hidrolizan los lípidos en el
 exterior de la célula, generando moléculas más pequeñas que pueden introducirse para participar en el metabolismo
celular. Algunos de los productos de la hidrólisis de la lecitina son insolubles y precipitan en el medio de cultivo(prueba
positiva).

PRUEBA NEGATIVA PRUEBA POSITIVA

El microorganismo no El microorganismo
secreta lipasas, por lo secreta lipasas que
que no se observan hidrolizan la lecitina
cambios en el medio de produciendo un
cultivo alrededor del precipitado alrededor
crecimiento microbiano. del crecimiento
microbiano.

15) Hidrólisis del Almidón.

El objetivo de esta prueba es investigar la producción de exoenzimas amilasas.

Composición del medio Agar Almidón:

Inoculación del medio: el medio se presenta en cajas de Petri, se inocula con un asa bacteriológica
mediante una estría recta en la superficie. La caja de Petri se puede dividir en 2 o 4 partes para
determinar la hidrólisis del almidón en varios microorganismos a la vez.

Incubación del medio: a 37 °C, durante 24- 48 horas

Interpretación de resultados:
El almidón es un polímero de α-glucosa que puede estar lineal o ramificado, se requiere α-amilasa para la lineal y la β-
amilasa (las dos exoenzimas) para hidrolizarlo.

El almidón puede hidrolizarse de manera parcial, esto da como

resultado una mezcla de dextrinas, maltosa, maltotriosa e isomaltosa.
Este hecho se puede hacer evidente al momento de revelar la prueba.

Revelado: el revelado de la prueba se hace adicionando unas gotas de

solución de KI/I (yodo yodurado o Lugol) cerca del crecimiento
bacteriano. El yodo se puede unir a la estructura del almidón, sus
cargas negativas se transfieren y esto ocasiona que la molécula
absorba más luz visible, excepto la luz de color azul. El almidón forma un complejo color azul con el yodo, por lo que si se
observa un halo claro alrededor de la colonia, quiere decir que no hay almidón (prueba positiva). Si se observara un
color azul alrededor del crecimiento la prueba será negativa, lo que indica la presencia del almidón. Cuando la hidrólisis
del almidón es parcial, se observa una coloración roja.

Prueba Prueba Prueba

positiva negativa positiva

Prueba
Medio sin inocular positiva