Fundamento tcnicas microbiologa

1. Preparar frotis bacteriano: gota de agua en un porta, esterilizacin de

asa, tomar muestra de cultivo, realizar frotis con asa, fijar a la llama.
2. Teir con cristal violeta 1min
3. Lavar
4. Lugol 1 min
5. Lavar
6. Decoloracin: alcohol-acetona 30 seg.
7. Lavar
8. Teir con Safranina 1 min
9. Lavar
10. Secar la preparacin
11. Observar (100x)
Agares
1. Mc Conkey: selectivo: solo bacilos gram (-) y diferencial:
Fermentadores de Lactosa: rosada
No fermentadores de Lactosa: transparente
2. SS (Salmonella-Shiguella): selectivo: solo gram (-) y diferencial por
fermentadoras de lactora y no (rosado-transparente).
*colonias centro negro: productoras de SH
2:
Salmonella, no Shiguella.
3. TCBS (Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sacarosa):



Batera Bioqumica Bacilos gram (-):
1. TSI (Triple Sugar Iron Agar):
Fermentacin de glucosa, lactosa y sacarosa: produccin de
cido y gas
Indicador: rojo fenol: alcalino rojo, cido amarillo
Produccin de H
2
S(ppdo negro) (gas) a partir de aa azufrados
(cistina, cistena y metionina) por presencia de enzima
disulfhidrasa)
Interpretacin:
o Agar tendido:
A= acidez/amarillo; fermentacin de Lactosa y/o
Sacarosa.
K= Alcalinidad/rojo; ausencia de fermentacin de
Lactosa y/o sacarosa
o Agar Profundo:
A= acidez/amarillo; fermentacin de glucosa.
K=alcalinidad /rojo; ausencia de fermentacin de
glucosa
Produccin de gas: ruptura del agar
Produccin de H
2
S: ennegrecimiento
2. LIA (Lysine Iron Agar):
A: acidez/amarillo; sin descarboxilacin de lisina
K: alcalinidad/violeta; descarboxilacin de lisina a cadaverina
R: rojo; desaminacin de la lisina
3. MIO (Movilidad Indol Ornitina):
Movilidad: (+): enturbiamento del agar
(-):agar transparente , crecimiento o turbidez solo en
la picadura.
Indol: (+): anillo rojo con reactivo de Kovacs (produccin de indol
derivado del triptfano).
(-): no hay variacin de color del reactivo
Ornitina: K=alcalino/violeta;descarboxilacin de la ornitina
(producto putrescina)
A= acidez/amarillo; ausencia de descarboxilacin
*Las serologas se hacen a partir del agar MIO
4. Citrato: (+)= azul (uso de citrato de sodio, como nica fuente de
carbono para su metabolismo y crecimiento)
(-): verde (color original)
5. Urea: ureasa (+)=rosado (hidrlisis de urea con produccin de CO2 y
amonaco carbonato de amonio alcalinizacin del medio)
Ureasa (-): mismo color del medio

Oxidasa: Significa que la bacteria si posee citocromo c oxidasa, por lo
que puede usar oxigeno en la produccin de energa con una cadena
de transporte de electrones. Un ejemplo de identificacin pre-eliminar
es la identificacin de los gneros Neisseria y Moraxella, los cuales
ambos son diplococos Gram-negativos oxidasa positiva. Muchos Gram-
negativos, como los bacilos curvados como Helicobacter pylori, Vibrio
cholerae y Campylobacter jejuni son oxidasa positiva.
Las enterobacterias son las tpicas oxidasa negativa.
4
El que no la
poseen significa que no puede usar el oxigeno en la cadena de
transferencia de electrones o aplican una citocromo diferente para
transferir electrones al oxigeno.

Hidrlisis de arginina: FUNDAMENTO: Se trata de detectar la hidrlisis
de la arginina mediante la enzima que transforma este aminocido en
citrulina, con liberacin de amoniaco.TECNICA: Se inocula un tubo de
caldo-arginina y se incuba junto a un tubo testigo estril durante 24 h
(en ocasiones 2-7 das). Transcurrido este tiempo se deposita una gota
del acultivo sobre un portaobjetos y se aade una gota del reactivo de
Nessler, que reacciona con el amoniaco. El desarrollo de un color entre
anaranjado y marrn, indica la presencia de amoniaco. El tubo estril
que sirve de control debe ensayarse al mismo tiempo y debe ponerse
de color amarillo plido o no mostrar ninguna reaccin coloreada.

RESULTADO +: Color anaranjado-marrn.
RESULTADO -: Color amarillo plido o ausencia de color.


Hidrlisis de Hipurato: Fundamento:
Detectar la capacidad del la bacteria de hidrolizar el hipurato mediante
la enzima hipuricasa.
La hidrlisis del hipurato dar como resultado glicina, que reaccionar
con la Ninhidrina provocando un cambio de color.
Mtodo:
- Realizar una suspensin bacteriana en 0.01 ml de agua destilada
- Aadir un disco de hipurato
- Incubar durante 2 horas a 37C
- Revelar la suspensin aadiendo II gotas de Ninhidrina para detectar
la formacin de glicina
- Incubar durante 30 minutos a 37C
Interpretacin de los resultados:
La aparicin de un color prpura intenso pondr de manifiesto la
presencia de glicina, dando como resultado una prueba positiva.
Si el hipurato no se hidroliza a glicina, tras la adicin del reactivo de
Ninhidrina no habr cambio de color dando como resultado una
prueba negativa.

Prueba de oxidacin fermentacin: (O/F)
Fundamento: los organismos sacarolticos (fermentan azcares)
degradan glucosa ( por va fermentativa u oxidativa), el producto final
de la degradacin oxidativa (A/N) ,son cidos dbiles, para detectarlos
se necesita medio ms sensible a la oxidacin (Hugh y Leifson).
Se necesian dos tubos:
Cerrado: con 1 cm de vaselina lquida esteril o parafina fundida
Abierto: sin sellar.
Incubar ambos a 35C
Interpretacin:
Abierto Cerrado Metabolismo
cido (amarillo) Alcalino (verde) Oxidativo
cido (amarillo) cido (amarillo) Fermentativo
Alcalino (verde) Alcalino (verde) No sacaroltico

Catalasa: Fundamento: la catalasa descompone el perxido de hidrogeno
(H
2
O
2
) en agua e hidrgeno. A excepcin de los Streptococcus y
Enterococcus, la mayor parte de las bacterias aerobias y anaerobias
facultativas poseen actividad catalasa. Procedimiento: con un asa transferir
parte de la colonia a la superficie de un portaobjetos, agregar una gota de
perxido de hidrgeno al 3% y observar la formacin de burbujas.
Coagulasa: Fundamento: coagulasa convierte el fibringeno en fibrina, lo
que da como resultado la formacin de un coagulo visible. Coagulasa libre
(prueba en tubo): similar a la trombina presente en los filtrados de los
cultivos, procedimiento: emulsionar una colonia del microorganismo en un
tubo que contenga 0.5 ml de PLASMA para pruebas de coagulasa, incubar el
tubo a 35C durante 4hrs y observar si se forma el coagulo inclinando
ligeramente el tubo, si no hay coagulo incubar a T ambiente y leer luego de
18hrs.
Agar DNAsa: Medio de cultivo utilizado para la deteccin de enzimas
desoxirribonucleasas. Es especialmente til para la diferenciacin entre
especies de estafilococos, as como para la diferenciacin
de Serratia spp. de especies de Klebsiella y Enterobacter. Siembra
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, sembrar un
inculo denso, ya sea en estra o por la tcnica de spot.
Incubacin : En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 C.
Cubrir la placa con cido clorhdrico 1N, y observar dentro de los primeros 5
minutos. Resultados: Positivo: halo claro, transparente alrededor del
crecimiento bacteriano. Negativo: el medio se observa opaco.
Resistencia a Novobiocina: preparar suspensin o.5 de Mc Farland del
microorganismo a estudiar en caldo o agua destilada estril. Distribuir la
suspensin en la mitad de una placa de agar sangre. Colocar disco de
Novobiocina en el rea sembrada. Incubar a 35C durante 18-24 hrs.
Interpretacin: Resistente a Novobiocina 12 mm de halo de inhibicin.
Sensible: halo 16 mm.
PYR: sustrato es la pL-pirrolidonil--naftilamida, este compuesto es
hidrolizado por una aminopeptidasa especfica bacteriana. La hidrlisis libera
-naftilamida libre, que se detecta por el agregado de N-
dimetilaminocinnamalddehdo, que se une a la naftlamida para formar una
base de Schiff roja.
Test de Camp: Los estreptococos del grupo B (S. agalactiae) producen una
protena difusible y termoestable (factor CAMP) que aumenta la beta-
hemlisis de Staphylococcus aureus. S. aureus (sembrado desde la parte
superior hasta la parte inferior de la placa) produce esfingomielinasa C que se
puede unir a las membranas de los eritrocitos. Cuando son expuestas al
factor CAMP del grupo B, las clulas sufren hemlisis.

Prueba de sensibilidad a bacitracina y trimetoprim-sulfametaxol
(cotrimazol) (SxT): Identificacin presuntiva de Streptococcus hemolticos
de los grupos A y B. Usar disco de bacitracina (Taxo A, 0.04 unidades/disco) y
disco SxT (1.25g/23.75g). Procedimiento: tomar 3 o 4 colonias y estriar
hasta el centro de la mitad de una placa de Agar Sangre, con hisopo estril o
asa diseminar el inculo sobre toda la mitad de la placa. Colocar en forma
estril disco TAXO A y SxT sobre el rea sembrada. Incubar por 18-24 hrs a
35C. Interpretacin: Sensible = cualquier tamao de halo, Resistente =
desarrollo hasta el borde del disco. Se informa como estreptococo
betahemoltico presumiblemente grupo A/no grupo A por prueba de
bacitracina-SxT.
Bacitracina SxT Identificacin
S R Presumible grupo A
R R Presumible grupo B
S/R S Ni grupo A ni B

Sensibilidad a Optoquina: Con asa seleccionar 3-4 colonias del
microorganismo a estudiar, y estriarlas en la mitad de una placa de Agar
sangre. Colocar disco de optoquina en el centro del rea centrada. Incubar a
35C por 18-24 hrs en jarra con vela (3-5%) CO
2
). Sensible : halo 14 mm
alrededor de disco de 6 mm (Taxo p) o 16 mm alrededor de disco de
10mm(Bacto). *Individuos con halos menores probar solubilidad en bilis.
Tincin de Zihel Neelsen:
Cubrir portaobjetos con fucsina filtrada
Calentar hasta emisin de vapores 3 veces durante 5 min
Lavar con agua
Cubrir con decolorante durante 3 min
Lavar con agua
Cubrir con azul de metileno durante 1 min
Lavar con agua
Secar al aire
Fundamento: Manifiesta la capacidad de resistir a la decoloracin
gracias al altocontenido de lpidos complejos (cidos miclicos) y ceras
que poseen algunos microorganismos en su pared celular. Los que
resisten la decoloracin se llaman cido alcohol resistentes (AAR) y se
ven rojos mientras que se tien azul son los no cidoalcohol
reisistentes(no AAR).