PRACTICA No 8

METABOLISMO BACTERIANO
Estrada, C. 4105221; Mutumbajoy, A. 4115311; Moreno, I. 2065332; Zambrano, H. 4100211
1
Facultad de Ingeniería y Administración., 2Facultad de Ciencias Agropecuarias
Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira.

RESUMEN

El metabolismo bacteriano comprende los procesos químicos en los cuales los organismos crecen y se mantienen, para
ello se realizan determinadas evaluaciones bioquímicas como: la prueba OF (oxidación–fermentación), determinar la
capacidad de fermentación de la glucosa, la prueba de Filancia que confirma que es una bacteria Gram Positiva. Los
resultados obtenidos en cada una de las pruebas permitieron la determinación y evaluación microbiológica de la bacteria
perteneciente al género Bacillus y especie Sphaericus. El objetivo de la práctica fue determinar la actividad metabólica de
la bacteria en diferentes condiciones de siembra y sustratos. Como resultado se obtuvo que la bacteria es aerobia,
presenta intolerancia a la sal, utiliza eficientemente los carbohidratos presentes en los diferentes medios.

Palabras clave: evaluaciones bioquímicas, metabolismo, bacteria, fermentación, género, familia.

los siguientes: Hisopos estériles, toalla de papel
INTRODUCCIÓN desechable, asa bacteriológica, asa micológica, 3
Para realizar las actividades químicas organizadas
requeridas para crecer y duplicarse, los pipetas de 1ml estériles, 2 pipetas Pasteur estériles,
microorganismos deben tomar materiales del ambiente y 10ml de parafina estéril fundida, portaobjeto 1 pinza
transformarlos mediante una serie de reacciones que se metálica de punta fina, lámpara de luz Uv (245nm),
conocen como metabolismo. Los cuales comprenden incubadora de 35 +- 2 OC, refrigerador de 4 OC,
dos partes: la extracción y utilización de energía y del estereoscopio, Reactivo Kovac´z, Reactivo rojo de
poder reductor del medio que rodea al microbio. La metilo, Reactivo de Barrit, KOH 40%, HCL 1M, 0,3 ml de
primera parte denominada catabolismo, comprende plasma, solución de Iodo-ioduro de potasio (lugol de
aquellas transformaciones tendientes a obtener energía Gram), 4 sensidiscos comerciales de antibióticos,
de los compuestos tomados del medio, la cual es peróxido de hidrogeno 3%, 1 regla con divisiones en
transferida y almacenada temporalmente dentro de la milímetros, 1 tira prueba oxidasa, 2 tubos agar OF, 1
molécula de ATP. La segunda parte comprende el uso tubo con 0,3ml de caldo BHI, 1 tubo en bisel con Agar
de esta energía en las reacciones bioquímicas King-A y uno con King-B, 5 tubos con caldo rojo de fenol
endergónicas, requeridas para transformar las con campaña Durham modificado con glucosa, lactosa,
sustancias tomadas del medio y adaptarlas a las galactosa, sacarosa y manitol respectivamente, 2 tubos
necesidades constructivas del organismo; estas de caldo nutritivo, 1 tubo de agua peptona 0,1%
transformaciones dirigidas a la síntesis se denominan modificada con 1, 5 y 20% de NaCl, 1 tubo de agar TSI
anabolismo. (Bock, 1978). en bisel, 1 tubo con agar Citrato de Simmons en bisel, 2
tubos de caldo RM-VP, 1 tubo con caldo o agar recto
Las principales rutas metabólicas mediante las cuales urea, 1 tubo con agar gelatina, 1 tubo de agar SIM recto,
las bacterias obtienen su energía son: La fermentación 1 caja Petri agar almidón, 1 con agar DNAsas y 1 con
es un proceso anaeróbico que ocurre sin aceptor agar Muller Hinton
externo de electrones, el compuesto orgánico
fermentable se oxida parcialmente y la bacteria solo Prueba de oxidasa: se adiciona reactivo tetrametil-p-
obtiene una cantidad pequeña de energía, la restante fenilendiamina a una tira de oxidasa a la cual se le
queda en productos intermediarios de oxidación. En la agrega una alícuota generosa de muestra bacteria;
respiración aeróbica los donadores de electrones son Prueba de catalasa: En un portaobjetos colocar una
compuestos orgánicos o inorgánicos reducidos y el gota de peróxido de hidrogeno y se transfiere con un
aceptor final es el O2; la cantidad de ATP considerable asa bacteriológica estéril una alícuota del
mente mayor que se produce se debe a la fosforilación microorganismo proveniente de un cultivo de 24 horas y
oxidativa. En la respiración anaeróbica no se requiere la se emulsiona.; Prueba de Oxidación – Fermentación:
presencia de aire; participa un aceptor externo de se inocula por punción los tubos con agar semisólido
electrones diferente al O2 por ejemplo NO3-, SO4= o CO3= hugh-Leifson que contienen como indicador de pH azul
y se genera menos ATP. La fotosíntesis consiste en la de bromocresol y se incuba a 35oC durante 48 horas,
absorción de la energía luminosa por la clorofila y otros uno de los tubos se sella con parafina para crear un
pigmentos y su conversión en energía química (ATP) medio anaerobio y el otro no-sellado; Prueba
que se utiliza para la reducción del CO2 de la atmosfera Fermentación de Carbohidratos: El caldo de glucosa
a carbohidratos. (Sánchez de Prager et al, 2000) se dispensa en 5 tubos los cuales se le agrego la
campana Durham invertida, se inocula con un asa y se
METODOS Y MATERIALES incuba a 35oC durante 48 horas, este medio ha sido
Los materiales que fueron utilizados para desarrollar la modificado cada uno de los tubo con diferentes
práctica de laboratorio de microbiología general fueron carbohidratos glucosa, galactosa, lactosa, sacarosa y
manitol; Prueba Triple sugar iron TSI: se inocula por
siembra mixta en tubos de bisel que contiene glucosa,
sacarosa y lactosa en un medio único y se incuban a
35oC durante 18-24 horas. Crecimiento aerobio-
anaerobio: Los tubos con caldo tioglicolato de sodio se
inoculan con el asa bacteriológica y se incuban a 35 oC
durante 48 horas. Prueba producción de indol: Se
utiliza el reactivo p- dimetilaminobenzaldehido en un
medio rico con triptófano, el medio preparado se inocula
con asa bacteriológica y se incuba a 35 0C durante 18 a
24 horas, y cuando finaliza esa incubación se le adiciona
cinco gotas del reactivo de Kovac`s en la pared del tubo.
Prueba Ureasa: El caldo urea es inoculado con asa
bacteriológica a 350C durante 24 horas. Prueba Citrato:
Se utiliza agar citrato de Simmons dispensado en tubos
inclinados, los cuales se inocularon por siembra mixta,
se incuba a 350C durante 24 horas y hasta 4 días.
Prueba de decarboxilación de Lisina: Se utiliza agar
LIA el cual esta dispensado en tubos en bisel, inoculado
por siembra mixta, un cultivo 24 horas, se incuba a 35 0C
durante 24 horas. Prueba de Desoxiribunecleasa: Se
utiliza una caja de Petri estéril con agar DNAsa y se
realiza la siembra del microorganismo por agotamiento,
se incuba a 350C durante 18 a 24 horas, Prueba de
Pigmentos: Se toman 2 tubos de ensayo, uno con
medio King A y otro con medio King B, se esterilizan y
se inclina para la polimerización, se inoculan por
siembra en estría y se incuban a 350C durante 24
horas, se procede a la observación del los resultados
con exposición a los rayos UV; Prueba de Coagulasa:
Se inocula una colonia en un tubo estéril que contiene
0,5 Ml de plasma de conejo y 0,5 caldo BHI, se incuban
a 350C a 24 horas, luego de 4 horas de incubación debe
hacerle una observación de los tubos; Prueba
Hidrólisis de Almidón: Se realiza en medio agar
almidón, los cuales están dispersos en cajas de Petri, la
cual es sembrada la bacteria por agotamiento y se
incuba a temperatura optima del microorganismo por 24
horas, para revelar la prueba se adiciona en la superficie
del agar una solución de Iodo-Ioduro de Potasio (lugol).
Antibiograma: Se utiliza una caja con agar Muller
Hinton, sensidiscos y antibióticos, se incuba una caja de
Petri con el microorganismo por siembra masiva y se
colocan los sensi-discos con los antibióticos repartidos
equitativamente en la superficie de la caja, se incuban a
370C durante 24 horas, Prueba tolerancia de la
salinidad: se utilizan 3 tubos de ensayo con agua de
peptona 0,1 modificada con 1% de NaCl, 5% NaCl y
20% NaCl, y se incuban, Prueba Hidrólisis de
Gelatina: se utiliza un tubo con agar gelatina y se hace
una punción recta, se lleva a incubación, y al momento
de leer la prueba se dejan los tubos durante 10 – 15
minutos en el refrigerador para tener un resultado real;
Prueba de Filancia: Se adiciona hidróxido de potasio
(KOH) al 3% a colonias de bacterias de 24h de
crecimiento ubicadas en el centro del portaobjetos;
Utilización de citrato como única fuente de carbono:
Inocular realizando una siembra por agotamiento en la
superficie del agar inclinado. Incubar a 37ºC durante 24
horas. Tras el periodo de incubación se procede a la
lectura de los resultados; Utilización de Citrato como
única fuente de Carbono: Incubar en el tubo de
ensayo, posteriormente añadir reactivo de Griess 2B,
detectando la presencia de nitritos virando la solución a
rojo.
RESULTADOS Y DISCUSION
Prueba Oxidasa: (+) cambio de coloración a azul,
identificando cepas bacterianas, con presencia de la
enzima citocromo oxidasa, que está constituida por
hemoproteínas capaces de catalizar la oxidación de un
citocromo reducido por el oxigeno molecular en la
cadena de transporte de electrones, oxidando
rápidamente el colorante redox presente en las antiras o
almohadillas virando la superficie a azul.
Prueba Catalasa: (+) Efervescencia, indicando la
presencia en la cepa bacteriana de la enzima catalasa la
cual degrada el H2O2 en H2O Y O2, protegiendo a las
células frente al peróxido de hidrogeno producido en el
metabolismo del oxigeno.
Prueba Oxidación - Fermentación: (+) Oxidación, tubo
amarillo en la superficie solamente; las bacterias
oxidaron la glucosa hasta gas CO2, el oxigeno es el
aceptor final de electrones en el metabolismo
respiratorio; teniendo en cuenta que las bacterias solo
pueden utilizar la glucosa por vía fermentativa, en el
tubo aun hay una porción anaeróbica que es el fondo del
tubo en donde no viró el medio a amarillo, ni siquiera el
tubo sellado con parafina.
Fermentación de carbohidratos: Se utilizaron 5
carbohidratos, todos con producción de gas (-). El
manitol y la Galactosa produjeron ácidos a
consecuencia de la fermentación (+). La sacarosa,
glucosa y lactosa viraron a rojo indicando medio
alcalino, pH superior a 7, es decir fermentación (-).
Prueba Triple Sugar Iron: Fermentación Glucosa (+),
Sacarosa y lactosa (+), producción gas (-) y sulfuro (-).
El medio TSI tiene una cantidad limitada de glucosa y es
10 veces mayor de lactosa, metabolizando este azúcar
primero ya que las enzimas que utilizan la glucosa son
constituyentes de las bacterias, y estas pueden obtener
mayor energía por uso del azúcar más simple, después
de haber agotado la cantidad limitada de glucosa, una
bacteria tiene capacidad para fermentar la lactosa, o
sacarosa comenzando a degradarlas. Las bacterias
encuentran sustrato suficiente para continuar la
formación de productos finales ácidos, luego de
incubación todo el medio TSI viró a color amarillo, esta
reacción es acido – acido (K/K) y el microorganismo se
identifica como fermentador de lactosa, sacarosa y
glucosa, producción de H2S a partir de tiosulfato, fue
negativa ya que no hay precipitado FeS (color negro).
Prueba Aerobia – Anaerobia: Aerobia (+), ya que hubo
crecimiento de la bacteria en forma de precipitado en el
tubo sin sellar con parafina, indicando la utilización de
Oxigeno como estrategia metabólica.
Prueba Producción Indol: Motilidad (+), Indol (-) y
H2S (-). Expone la capacidad de movilidad de la
bacteria, Carece de la acción enzimática de los
aminoácidos que contienen azufre las cuales producen
una reacción visible de color negro que no se pudo
apreciar en el tubo, y por último la capacidad de
desdoblar indol de la molécula triptófano, la bacteria en
esta prueba dio resultado negativo no hubo producción
de H2S, causada por la falta liberación de azufre
enzimáticamente de los diferentes AA que conforman la
proteínas, por ende no hay su producción, no hubo
oxidación del aminoácido triptófano, por lo cual no forma
metabolito indol, se observo un anillo de color amarillo
en la superficie, no se observo movimiento representado
en ramificaciones cercanas a la estría, las bacterias
tienen movilidad por flagelos a veces contienen solo
unos o muchos, su localización varia de la especie y de
las condiciones del cultivo
Prueba Ureasa: (-) Tubo amarillo; La ausencia de la
Ureasa en la bacteria utilizada, impidió la hidrolizacion
de la urea, consecuentemente no se alcalinizo ni
aumento el pH del medio, Cabe añadir que el
crecimiento del microorganismo fue normal.
Decarboxilación de lisina: LIA (+), H2S (-). A
consecuencia de la Decarboxilacion de lisina, se
producen aminas que provocan el color violeta es decir
bisel alcalino/ fondo alcalino
Prueba Desoxiribonucleasa: Translucido (+). Por la
producción de DNAsa que causa la degradación del
ADN a fracciones de menor peso molecular al ser
incubados formando un halo translucido sobre la
superficie del agar.
Pigmentos: King A (-), King B (+). Al presentar solo
pigmentacion fluoresceína se clasifica como una
Pseudomonas Fluorescens, produciendo fluorescencia
amarilla al llevarlo a la cámara UV a 254 nm.
Prueba Coagulasa: Medio solido (-). Detectó la
presencia de Coagulasa, presente en el filtrado del
cultivo que actuó sobre el plasma. Es una enzima capaz
de desnaturalizar la bibrina del plasma, el objetivo es
buscar el factor de aglutinación de los microorganismos
cuando estos se mezclan con el plasma. El Resultado
dio negativo, por lo tanto el plasma permanece líquido.
Hidrólisis de almidón: Hidrólisis (-). El reactante Lugol
reacciona con las moléculas de almidón del agar
formando un color violeta, indicando la no producción de
enzimas amilasas que hidrolicen polisacáridos como el
almidón, por lo tanto no lo pueden utilizar como sustrato
para su crecimiento.
Antibiograma: el antibiótico más efectivo es APR 15
(2,5cm de radio); se debe a la interaccion con DNA
girasa bacteriana, impidiendo que la girasa produzca un
DNA bacteriano superenrollado, necesario para el
empaquetamiento del DNA en la célula bacteriana.
(Brock, T.)
Prueba Tolerancia a Salinidad: (-). Se observo que la
bacteria no creció sobre los tres medios con diferentes
niveles de salinidad, descartándola como bacteria
halófila.
Hidrólisis de gelatina: Hidrólisis (-). La bacteria no
produce este gelatinasas, no pueden desdoblar, ni
utilizar proteínas ya que deben hidrolizarlas debido a
que naturalmente son demasiado grandes para poder
entrar en una célula bacteriana.
Filancia: Gram Positivas (+). No Hubo formación de
Hilos corroborando el resultado con resultado de prueba
gram de laboratorio de morfología.
Utilización de Citrato como única fuente de Carbono:
(-). No utilizó las sales de amonio es decir no hubo
proceso de alcalinización.
Reducción de Nitratos: Presencia de Nitritos (-). El
reactivo de griess 2B no detectó nitritos, es decir no
hubo reducción de nitratos a consecuencia no cambio
de color al inicial, al agregarle polvo de zinc, resulto una
coloración roja indicando la reacción con nitratos.
CONCLUSION
Según los resultados obtenidos en cada una de las
pruebas, y con ayuda de la tabla modificada Cowan´s &
Steel, que nos permitió clasificar esta bacteria al género
Bacillus spp; Asimismo logramos identificar la especie
con Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology
Llegando a la conclusión que nuestra bacteria pertenece
a Bacillus sphaericus perteneciente a la División
Firmicutes, clase Bacilli, Orden Bacillales y familia
bacillaceae, gram positivas, viven en el suelo,- coincide
con el origen de donde se hizo el muestreo para la
obtención de la bacteria que se ha utilizado hasta el
momento en laboratorio-, aparte de alimentos que
contaminan con su presencia.
BIBLIOGRAFIA:
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sexta edición. Buenos Aires. (1962). Pág. 626.
BROCK, T. BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS.
España. Ediciones Omega S.A., (1978). Pág. 774.
CATOGUE OF LIFE, BACTERIOLOGY INSIGHT BIOS
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MAC-FADDIN, J. PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA
IDENTIFICACION DE BACTERIAS DE IMPORTANCIA
CLINICA. Buenos Aires (Argentina). Editorial medica
panamericana S.A. (2003).
ROJAS, A. CONCEPTOS Y PRÁCTICA DE
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Nacional de Colombia Sede Palmira. Pág. 79-101.