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Las sustituciones del dominio de aciltransferasa en la policétido sintasa de eritromicina producen

nuevos derivados de eritromicina

ArtículoenRevista de Bacteriología · Noviembre 1997

DOI: 10.1128/jb.179.20.6416-6425.1997 · Fuente: PubMed

CITAS LECTURAS

130 1.349

11 autores, incluido:

Richard Summers Michael J. Staver

universidad del sur Universidad de Illinois en Chicago

18PUBLICACIONES1,105CITAS 18PUBLICACIONES2,712CITAS

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Stefano Donadio Leonardo Katz

NAICOS Srl Universidad de California, Berkeley

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jOURNAL DEBACTERIOLOGÍA, octubre de 1997, pág. 6416–6425 vol. 179, núm. 20
0021-9193/97/$04.0010
Copyright © 1997, Sociedad Estadounidense de Microbiología

Las sustituciones del dominio de aciltransferasa en la policétido

sintasa de eritromicina producen nuevos derivados de eritromicina
XIAOAN RUAN, ANA PEREDA, DIANE L. STASSI, DAVID ZEIDNER, RICHARD G. SUMMERS, MARIANNA
JACKSON, ANNAPUR SHIVAKUMAR, STEPHAN KAKAVAS, MICHAEL J. STAVER,
STEFANO DONADIO,†YLEONARDO KATZ*
Investigación de descubrimiento de antibacterianos, Laboratorios Abbott, Abbott Park, Illinois 60064

Recibido el 17 de junio de 1997/Aceptado el 29 de julio de 1997

Los dominios de aciltransferasa (AT) específicos de metilmalonil coenzima A (metilmalonil-CoA) de los módulos 1 y 2 de
la 6-desoxieritronolida B sintasa (DEBS1) deSaccharopolispora erythraeaER720 se reemplazó con tres dominios AT
heterólogos que, según comparaciones de secuencias, se cree que son específicos de malonil-CoA. Los tres dominios AT
sustituidos eran AT2 "Hyg" del módulo 2 de un grupo de genes similar a la policétido sintasa (PKS) de tipo I aislado del
productor de rapamicina.Streptomyces higroscópicoATCC 29253, AT “Ven” aislada de un grupo de genes similares a PKS del
productor de pikromicinaStreptomyces venezolanaATCC 15439 y RAPS AT14 del módulo 14 del grupo de genes rapamicina
PKS deS. higroscópicoATCC 29253. Estos cambios condujeron a la producción de nuevos derivados de eritromicina
mediante cepas modificadas genéticamente deS. erythraeaER720. Específicamente, las cepas en las que se reemplazó el
dominio AT1 residente produjeron 12-desmetil-12-desoxieritromicina A, que carece del grupo metilo en el C-12 del anillo
de macrolactona, y 10-desmetileritromicina A y 10-desmetil-12 -desoxieritromicina A, las cuales carecen del grupo metilo
en el C-10 del anillo de macrolactona, fueron producidas por las cepas recombinantes en las que se reemplazó el dominio
AT2 residente. Todos los nuevos derivados de eritromicina mostraron actividad antibiótica contraEstafilococo aureus. La
producción de derivados de eritromicina a través de reemplazos de AT confirma las especificidades de sustrato predichas
por computadora de “Hyg” AT2 y “Ven” AT y la especificidad de sustrato de RAPS AT14 deducida de la estructura de la
rapamicina. Además, estos experimentos demuestran que al menos algunos dominios AT de la 6-desoxieritronolida B
sintasa completa deS. erythraeapueden ser reemplazados por dominios funcionalmente relacionados de diferentes
organismos para producir nuevos compuestos bioactivos.

La eritromicina A es un antibiótico macrólido de amplio espectro
clínicamente útil producido por la bacteria grampositiva.
Saccharopolispora erythraea. La eritromicina pertenece a una clase de
productos naturales llamados policétidos complejos que incluyen
muchos compuestos importantes, como el agente antihelmíntico
avermectina y los inmunosupresores FK506 y rapamicina. La
característica central de estos compuestos es un anillo de lactona
macrocíclico derivado de policétida que se sintetiza mediante una
condensación ordenada de tioésteres de acilo. Estos anillos
generalmente se construyen a partir de cadenas de carbono de
longitudes específicas y exhiben diferentes grados de reducción y
sustitución alrededor del anillo (8, 29, 32). Se ha reconocido desde hace
tiempo que la producción de policétidos se parece a la biosíntesis de
ácidos grasos (25, 43), pero con diferencias importantes (15). A diferencia
de una ácido graso sintasa, que generalmente inicia la síntesis de ácidos
grasos con acetil coenzima A (acetil-CoA) y extiende la cadena en dos
carbonos sin cadenas laterales, utilizando malonil-CoA como unidad
extensora, una policétido sintasa compleja (PKS) está programada. tomar
decisiones distintas en cada paso del ensamblaje de la cadena de
carbono. Estos incluyen la elección del iniciador entre varias
posibilidades, como acetil-CoA (oleandomicina), propionil-CoA
(eritromicina) e isobutiril-CoA (avermectina), elección de extensores de
cadena ramificados o no ramificados (p. ej., malonil-CoA [rapamicina],
metilmalonil-CoA [eritromicina] y etilmalonil CoA [tilosina]), y
determinación del grado de reducción de la
* Autor correspondiente. Dirección postal: Abbott Laboratories, D-47P
AP9A, 100 Abbott Park Road, Abbott Park, IL 60064. Teléfono: (847)
937-4132. Fax: (847) 938-3403. Correo electrónico: leonard.katz@abbott
. com.
† Dirección actual: Biosearch Italia spa, 21040 Gerenzano (VA),
Italia.
b-grupo ceto que se genera después de cada condensación (que
va desde sin reducción hasta solo cetorreducción,
cetorreducción y deshidratación, o cetorreducción,
deshidratación y reducción de enoilo).
La programación de policétidos está integrada en la estructura de
la PKS, que está determinada a nivel genético. Los genes (y
dominios enzimáticos) de una PKS compleja están organizados en
módulos (8, 29, 32, 37). Cada módulo codifica todas las funciones
necesarias para un evento de condensación único y específico y el
procesamiento correspondiente del recién formado.b-grupo ceto.
Cada módulo lleva un dominio cetosintasa (KS), una aciltransferasa
(AT) y una proteína transportadora de acilo (ACP). Además,b-
También pueden estar presentes los dominios cetorreductasa (KR),
deshidratasa y enoil reductasa (ER). Los dominios KS, AT y ACP son
responsables de la extensión de la cadena. Se cree que el dominio
AT determina qué extensor se incorpora en cada paso del
crecimiento de la cadena policétida (10, 12, 18), mientras que el
dominio KS es responsable de catalizar la reacción de condensación
real. Los dominios ACP unen la cadena policétida en crecimiento a la
PKS entre condensaciones y también aceptan unidades extensoras
de los dominios AT en preparación para una condensación.
El anillo de macrolactona de la eritromicina es sintetizado por la
eritromicina PKS, 6-desoxieritronolida B sintasa (DEBS) (Fig. 1). DEBS
contiene (i) seis módulos para programar las seis condensaciones
sucesivas entre el iniciador propionil-CoA y (ii) las seis unidades
extensoras de metilmalonil-CoA para construir el anillo de 6-
desoxieritronolida B (6-dEB) de 14 miembros (Fig. 1). El orden preciso de
los pasos de elongación es colineal con el orden genético de los seis
módulos: el módulo 1 determina la primera condensación, el módulo 2
determina la segunda, el módulo 3 determina la tercera, y así
sucesivamente hasta que se haya producido el sexto paso de
condensación (8). . En el caso de 6 dB, la unidad extensora para

6416
VOL. 179, 1997
HIGO. 1. Vía biosintética de la eritromicina A. Los genes biosintéticos de la eritromicina están agrupados en ca. segmento cromosómico de 65 kb deS. erythraea. Los genes
DEBS se denominaneryA(10), y algunos de los genes flanqueantes,eryF,eryK, yeryG, implicados en las modificaciones pospolicétidas. EleryByeryCgenes implicados en la síntesis
de los didesoxiazúcaresl-micarosa yD-desosamina también se encuentran en el grupo pero no se muestran. Se destacan los grupos hidroxilo introducidos por EryF o EryK.
cada condensación es metilmalonil-CoA, lo que da lugar al
patrón característico de grupos metilo alternos alrededor del
anillo 6-dEB. Aunque sólo el (2S)-estereoisómero de
metilmalonil-CoA se emplea en la síntesis de eritromicina (23), lo
contrario (2R) la estereoquímica se encuentra en tres de las seis
cadenas laterales de metilo. Queda por determinar si las
epimerizaciones tienen lugar durante o después de las
reacciones de condensación.
Los nuevos derivados de la eritromicina se han generado con
mayor frecuencia mediante modificaciones químicas del antibiótico.
Sin embargo, en los últimos años se han producido derivados
mediante cepas productoras de eritromicina genéticamente
alteradas. La 2-noreritromicina A y sus congéneres 2-
noreritromicina B, C y D fueron los primeros ejemplos del uso de
técnicas de ADN recombinante para producir nuevas estructuras de
eritromicina (24). Caracterización de los genes PKS responsables de
la biosíntesis de eritromicina enS. erythraeacondujo a la generación
de derivados a través de la manipulación dirigida deleryAgenes. Los
nuevos compuestos 5,6-didesoxi-3a-micarosil-5-oxoeritronolida B yD
6,7-anhidroeritromicina C se produjeron mediante mutación dirigida
del dominio KR en el módulo 5 y el dominio ER en el módulo 4,
respectivamente (9, 10). La producción de estos nuevos compuestos
ilustró que el ADN recombinante
DERIVADOS DE ERITROMICINA VÍA DE SUSTITUCIONES 6417
La tecnología se puede utilizar eficazmente para generar derivados de
eritromicina que son difíciles o imposibles de producir químicamente.
Con la evidencia reciente de que los dominios AT determinan el
extensor utilizado para cada paso de condensación durante el
crecimiento de la cadena de policétidos (26), se generó una serie de
nuevas eritromicinas que portan alteraciones de la cadena lateral
mediante ingeniería genética DEBS con dominios AT heterólogos que
incorporan malonil-CoA. Aquí, informamos que la biosíntesis de la
columna vertebral de carbono del anillo de macrolactona de eritromicina
se puede reprogramar mediante reemplazos de AT en DEBS1, dando
lugar a nuevos derivados de eritromicina que carecen de grupos metilo
en C-10 o C-12 del anillo de macrolactona.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas bacterianas, plásmidos y medios de crecimiento.Las cepas de actinomicetos y los
plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1.Escherichia coliLas cepas se
cultivaron en caldo Luria (30) suplementado con ampicilina (150 metrog/ml). Para el
crecimiento deS. erythraeacepas en cultivos líquidos, ya sea SGGP (44) o SCM (20 g de soya,
15 g de almidón soluble, 10,5 g de ácido morfolinopropanosulfónico [MOPS], 1,5 g de
extracto de levadura y 0,1 g de CaCl2por litro de H destilado2O) se utilizó medio. Para el
crecimiento deS. erythraeacepas en placas, se utilizó medio R3M. Un litro de medio R3M
contiene 4 g de extracto de levadura, 4 g de Casaminoácidos, 4 g de Bacto Triptona, 0,25 g de
K2ENTONCES4, 0,6 g de Tris base, 3,2 g de Tris-HCl, 2,5 ml de NaOH 1 M, 103 g de sacarosa,
22 g de agar y 940 ml de
6418 RUAN ET AL. JBACTERIOL.

TABLA 1. Cepas de actinomicetos y plásmidos utilizados

Cepa o plásmido Descripción Referencia o fuente

Cepas de actinomicetos
S. erythraeaER720 Tipo salvaje, productor de eritromicina 7
S. venezuelaeATCC 15439 Tipo salvaje, productor de pikromicina ATCCa
S. higroscópicoATCC 29253 Tipo salvaje, productor de rapamicina ATCC
S. erythraea
EryAT1/“Hyg” AT2 S. erythraeaER720 con DEBS AT1 reemplazado por “Hyg” AT2 Este estudio
EryAT2/“Hyg” AT2 S. erythraeaER720 con DEBS AT2 reemplazado por “Hyg” AT2 Este estudio
EryAT1/“Ven” AT S. erythraeaER720 con DEBS AT1 reemplazado por “Ven” AT Este estudio
EryAT1/RapAT14 S. erythraeaER720 con DEBS AT1 reemplazado por RAPS AT14 Este estudio
EryAT2/RapAT14 S. erythraeaER720 con DEBS AT2 reemplazado por RAPS AT14 Este estudio

Plásmidos
pNJ1 Actinomiceto-E. colicósmido que contienereps-pJVI 38
pAL58 Cósmido pNJ1 que contiene parte de un grupo de genes PKS "Hyg" aislado de 28
S. higroscópicoATCC 29253
pVen17 Cósmido pNJ1 que contiene un segmento de genes PKS "Ven" deS. venezuelae E. Este estudio
pWHM3 coli-Streptomycesvector de lanzadera que contienereps-pIJ702; se replica mal enS. 39
erythraea
pWHM3/EryAT1-flanco pWHM3 que contiene regiones flanqueantes de Este estudio
pWHM3/EryAT2-flanco EryAT1 pWHM3 que contiene regiones flanqueantes Este estudio
pWHM3/EryAT1/“Hyg” AT2 de EryAT2 pWHM3/EryAT1-flanco que contiene “Hyg” Este estudio
pWHM3/EryAT2/“Hyg” AT2 AT2 pWHM3/EryAT2-flanco que contiene “Hyg” AT2 Este estudio
pWHM3/EryAT1/“Ven” AT pWHM3/EryAT1-flanco que contiene “Ven” AT pWHM3/ Este estudio
pWHM3/EryAT1/RapAT14 EryAT1-flanco que contiene RAPS AT14 pWHM3/ Este estudio
pWHM3/EryAT2/RapAT14 Flanco EryAT2 que contiene RAPS AT14 Este estudio

aATCC, Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland.

h2O. Después de esterilizar en autoclave a 121 °C durante 20 min, se agregaron las siguientes
soluciones: 50003-solución concentrada de oligoelementos, 0,2 ml (14); Solución de glucosa
al 50%, 20 ml; MgCl 2,5 M2solución, 20 ml; 0,5% KH2correos4solución, 5 ml; y CaCl 2,5 M2
solución, 20 ml. Para la selección de resistentes al tiostreptón (Thior)S. erythraea cepas, 25
metroSe utilizaron g de tiostreptona/ml para el crecimiento en placas y 10metroSe utilizó g/
ml en cultivo líquido.
Manipulaciones de ADN.Se realizaron técnicas estándar de biología molecular como se
describió anteriormente (30). Para la secuenciación del ADN, se utilizaron como plantillas
ADN plasmídico desnaturalizado o ADN monocatenario preparados a partir de subclones de
pUC18/19 o M13mp18/19 (Bethesda Research Laboratories). Las secuencias de nucleótidos
se determinaron mediante el método de terminación de cadena de didesoxinucleósido (31),
utilizando ya sea elfmolSistema de secuenciación del ciclo de ADN (Promega Corp., Madison,
Wis.) o Sequenase versión 2.0 con 7-deaza-dGTP (US Biochemical, Cleveland, Ohio) según las
instrucciones del fabricante. Las secuencias se analizaron utilizando los programas de
análisis de secuencias de Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin) (6). Las búsquedas
en bases de datos para homología de secuencia con las secuencias de aminoácidos
deducidas se realizaron utilizando BLAST (1). Las alineaciones de secuencias de aminoácidos
se realizaron utilizando PILEUP y DENDROGRAM.
Clonación del ADN que codifica “Ven” AT.Una biblioteca genómica de
Streptomyces venezolanaATCC 15439 se construyó en el plásmido pNJ1 (38) y se
seleccionó utilizando una sonda hecha de 1,37 kb.smaFragmento que contiene parte
del dominio KS del módulo 2 deeryAI(10). Se aisló el cósmido pVen17 (Tabla 1) de la
biblioteca genómica y se caracterizó mediante análisis Southern. TresstSe encontró
que los fragmentos I se hibridaban con la sonda. Después se subclonó uno de los
fragmentos, de 4,0 kb de tamaño, en pUC19 para dar pVen4.0. El análisis de
secuencia reveló que el inserto en pVen4.0 contenía un dominio AT parcial y, en
consecuencia, la secuencia de nucleótidos se extendió usando ADN de pVen17 como
plantilla para obtener una secuencia de longitud completa del dominio AT (“Ven” AT).
Cebadores de PCR y subclonaciones de PCR.Se diseñaron siete pares de
cebadores oligonucleotídicos para la subclonación por PCR de los tres dominios AT
heterólogos y las cuatro regiones de ADN que flanquean los dominios DEBS AT1 y
DEBS AT2 utilizados en este estudio (Tabla 2). Los sitios de restricción únicos
introducidos para una subclonación conveniente están subrayados en cada
oligonucleótido. Los ADN molde utilizados para la clonación por PCR de los AT
heterólogos fueron pAL58 para "Hyg" AT2 (28), pVen17 para "Ven" AT (Tabla 1) y ADN
cromosómico aislado deStreptomyces higroscópicoATCC 29253 para RAPS AT14. El
ADN molde utilizado para subclonar las regiones que flanquean los dominios DEBS
AT1 y DEBS AT2 fue pAIEN22, un derivado de pUC19 que contiene un segmento de
ADN de 22 kb delerygrupo de genes PKS deS. erythraea.
Se utilizaron dos condiciones de PCR con resultados similares para subclonar el
característicamente alto G1Fragmentos de ADN de actinomicetos con contenido de C. (i) Los
100-metrol mezcla de reacción contenía 10metrol de 103Tampón de PCR (Bethesda Research
Laboratories), 2metrol de mezcla de trifosfato de desoxinucleósido 10 mM, 2 a 4metrol de
MgCl 50 mM2, 100 pmol de cada oligonucleótido y de 10 a 50 ng de ADN molde. El ciclo fue el
siguiente: un ciclo a 96°C durante 6 min y 80°C durante 1 min (TaqADN polimerasa agregada
durante este período); 30 ciclos a 95°C por 1 min, 65°C por 1 min y 72°C por 2 min, con una
extensión de 5 min a 72°C para el último ciclo. (ii) El
100-metrol mezcla de reacción contenía 10metrol de 103Tampón Thermopol (New
England Biolabs), 2% de glicerol, 10% de formamida, 100 pmol de cada
oligonucleótido y de 100 a 200 ng de ADN molde. La muestra se calentó a 99°C
durante 2 min y luego se enfrió a 80°C, momento en el cual 16metrol de una solución
de desoxinucleósido trifosfato (1,25 mM cada dATP y dTTP, 1,5 mM cada dCTP y
dGTP) y 1 metrolitros de ventilaciónRSe añadió ADN polimerasa (New England
Biolabs). El ciclismo fue el siguiente: 30 ciclos a 96,5°C durante 35 s, 65°C durante 1
min y 72°C durante 1,5 min, seguido de un ciclo a 72°C durante 3 min.
Los fragmentos de ADN amplificados por PCR que portaban los AT heterólogos se
subclonaron individualmente en elecológicoRHODE ISLAND/BamSitios HI de pUC18 para dar
pUC18/“Hyg” AT2 y pUC18/“Ven” AT o en elecológicoRHODE ISLAND/Hinsitios dIII de pUC19
para dar pUC19/RapAT14. Para las regiones flanqueantes amplificadas por PCR de DEBS AT1,
el fragmento aguas arriba [correspondiente a los nucleótidos del segmento (nt) 2781 a 3825;
Número de acceso a GenBank. M63676] fue subclonado en elecológicoRHODE ISLAND/Bam
sitios HI de pUC19 para dar pUC19/EryAT1/aguas arriba; el fragmento aguas abajo
(correspondiente al segmento nt 4866 a 5912) se subclonó en el BamHOLA/Hinsitios dIII de
pUC19 para dar pUC19/EryAT1/aguas abajo (ver Fig. 3B). Para las regiones flanqueantes
amplificadas por PCR de DEBS AT2, el fragmento aguas arriba (correspondiente al segmento
nt 7090 a 8255) se subclonó en el HinIII/pstsitios I de pUC19 para dar pUC19/EryAT2/aguas
arriba; el fragmento aguas abajo (correspondiente al segmento nt 9282 a 10368) se subclonó
en elpstI/ecológicoSitios RI de pUC19 para dar pUC19/EryAT2/aguas abajo (ver Fig. 3B). La
fidelidad de estos fragmentos amplificados por PCR se confirmó mediante la secuenciación
de ambas cadenas de ADN de los subclones.
Manipulación genética deS. erythraeaER720.Preparación de protoplastos deS. erythraea
ER720, la transformación de los protoplastos con derivados integrativos de pWHM3 (Tabla 1)
y la resolución de los integrantes se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos
descritos previamente (41, 44). Los protoplastos se transformaron de forma independiente
con los cinco plásmidos de reemplazo AT derivados de pWHM3. Para seleccionar
transformantes estables (integrantes) mediante recombinación homóloga, las colonias que
surgieron en las placas de transformación se volvieron a esparcir sobre placas R3M que
contenían tiostreptona (25metrog/ml). Luego, las colonias resistentes se inocularon en SGGP
que contenía tiostreptón (10metrog/ml) para asegurar que el tiory aislar ADN cromosómico
para confirmar el evento de integración mediante análisis de Southern. A continuación, los
integrantes confirmados se cultivaron en SGGP sin tiostrepton durante 4 días y luego se
sembraron en placas R3M no selectivas para la esporulación. Se sembraron suspensiones de
esporas en placas R3M para obtener colonias individuales, que luego se examinaron para
determinar su sensibilidad al tiostreptón, lo que indica la pérdida de la secuencia del
plásmido del cromosoma a través de un segundo evento recombinante homólogo. El análisis
Southern de las colonias sensibles a tiostreptón confirmó los genotipos deseados de los
resolventes.
Caracterización de derivados de eritromicina producidos por recombinantes.S.
erythraeapresiones.Para el análisis por cromatografía de capa fina (TLC), las células se
cultivaron en matraces con agitación en SGGP o SCM durante 4 a 5 días a 30 °C y luego se
eliminaron mediante centrifugación. El sobrenadante resultante se ajustó a pH 9,0 mediante
la adición de NH4OH y se extrajo dos veces con un volumen igual de acetato de etilo. La fase
orgánica, que contenía los macrólidos deseados, se secó en
VOL. 179, 1997 DERIVADOS DE ERITROMICINA VÍA DE SUSTITUCIONES
TABLA 2. Cebadores de PCR diseñados para construcciones de reemplazo de AT
una SpeedVac y se redisolvió en acetato de etilo para dar una concentración apropiada para
manchar en una placa de TLC (Gel de sílice Merck 60F-254). Se permitió la migración durante
aproximadamente 1,5 h, utilizando éter isopropílico-metanol-NH4OH (75:35:2), y los
derivados de eritromicina se visualizaron con un aerosol de anisaldehído-ácido sulfúrico
etanol (1:1:9).
Para la bioautografía por TLC, la placa de TLC se desarrolló como se describe
anteriormente, se secó al aire y se colocó en una placa de bioensayo estéril (245 por 245 por
25 mm). Luego se cubrió la placa con 150 ml de medio antibiótico 11 (Difco) que contenía 0,1
ml de un cultivo nocturno deEstafilococo aureuscomo cepa indicadora y se incubó durante la
noche a 37°C para visualizar zonas de inhibición.
Para la espectrometría de masas (MS), los extractos de acetato de etilo se separaron
mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) o TLC. Después de la separación por
TLC, la región de interés se raspó de la placa y se extrajo una vez con acetato de etilo-
metanol (1:1), seguido de dos extracciones con acetato de etilo. Luego, las fases orgánicas
combinadas se secaron en un SpeedVac y se enviaron para análisis de EM. Para la separación
por HPLC, la muestra se pasó a través de una columna Prodigy ODS (2) (5metrom, 50 por 2
mm) en un cromatógrafo líquido Hewlett-Packard 1050, usando una elución en gradiente de
acetato de amonio 5 mM y metanol a un caudal de 0,3 ml/min. El análisis de MS se realizó de
forma rutinaria con un espectrómetro de masas Finnigan-MAT 7000 equipado con una
fuente de ionización química a presión atmosférica. La EM por electropulverización se realizó
con un espectrómetro de masas Finnigan-MAT 752-7000 equipado con una fuente de
ionización a presión atmosférica Finnigan.
Para aislar 10 y 12-desmetileritromicinas para estudios estructurales de resonancia
magnética nuclear (RMN), se prepararon 30 litros de SCM en recipientes agitados de
acero inoxidable LH Fermentation Series 2000 de 42 litros y se esterilizaron a 121 °C y
15 lb/m.2durante 1 h. Inicialmente se añadió antiespumante (XFO-371; Ivanhoe
Chemical Co., Mundelein, Illinois) al 0,01% y luego estuvo disponible a pedido. Los
fermentadores se inocularon con 1,5 litros de crecimiento de semillas de segundo
pase de la cepa EryAT2/“Hyg” AT2 o EryAT1/“Hyg” AT2 deS. erythraea. La temperatura
se controló a 32°C. La velocidad de agitación fue de 260 rpm y el flujo de aire fue de
1,3 vol/vol/min. La presión en cabeza se mantuvo a 6 lb/m2, y el pH fue
6419
controlado a 7,3 con ácido propiónico 5 M. Las fermentaciones se terminaron entre
100 y 120 h. Los caldos de fermentación resultantes se ajustaron luego a pH 9 con NH
4OH y se extrajo dos veces con volúmenes iguales de CH2CL2. Los extractos se
reunieron y se concentraron al vacío hasta obtener un aceite.
Para la muestra de 10-desmetileritromicina, el material bruto concentrado se
extrajo dos veces con un volumen igual de fosfato potásico acuoso 0,05 M (pH 4,25).
La fase acuosa reunida se ajustó luego a pH 9 con NH.4OH y se reextrajo dos veces
con un volumen igual de acetato de etilo. Después de concentrar la fase orgánica, se
repitió la secuencia de retroextracción acuosa-reextracción orgánica. El residuo
oleoso que quedó después de la concentración de los extractos finales de acetato de
etilo combinados se digirió luego en 5 ml de cada una de las fases superior e inferior
de un sistema disolvente que constaba denorte-hexano, acetato de etilo y fosfato
potásico acuoso 0,02 M (pH 6,6), 6:4:5 (vol/vol/vol), y se cromatografió en un
instrumento de cromatografía contracorriente de gotitas personalizado (100
columnas verticales; 0,4 cm de diámetro por 24 cm de longitud) (16), utilizando la fase
inferior como fase móvil. Las fracciones se analizaron según su bioactividad frente aS.
aureusy por1RMN H. Las fracciones bioactivas se combinaron y se sometieron a una
serie de cinco separaciones cromatográficas en contracorriente en una centrífuga
Planet Coil multicapa Ito. Los sistemas de disolventes utilizados en cada paso fueron
los siguientes: (i) tricloroetileno-cloroformo-metanol-fosfato de potasio acuoso 0,02
M (pH 6,4), 3:1:3:3 (vol/vol/vol/vol), siendo el menor fase móvil; (ii) norte-hexano–
acetato de etilo–fosfato potásico acuoso 0,02 M (pH 7), 1:1:1 (vol/vol/vol), con la fase
superior móvil; (iii)norte-hexano–acetato de etilo–fosfato potásico acuoso 0,02 M (pH
8,1), 1:1:1 (vol/vol/vol), con la fase superior móvil; (iv)norte-butanol–acetona–fosfato
potásico acuoso 0,02 M (pH 6,5), 8:1:10 (vol/vol/vol), con la fase superior móvil; y V)
norte-hexano–acetato de etilo–fosfato potásico acuoso 0,02 M (pH 7), 1:1:1 (vol/vol/
vol), con la fase superior móvil.
Para la muestra de 12-desmetileritromicina, el material bruto concentrado se
extrajo dos veces con un volumen igual de fosfato potásico acuoso 0,05 M (pH 6).
Luego, la fase acuosa reunida se ajustó a pH 8 con NH.4OH y se reextrajo dos veces
como se describe anteriormente. Este proceso se repitió y el aceite
6420 RUAN ET AL.
HIGO. 2. Dendrograma generado a partir del análisis PILEUP de los
dominios AT. Las secuencias de aminoácidos de los dominios AT "Hyg" AT2 (28)
y "Ven" se alinearon con las de los dominios 14 RAPS AT y 6 DEBS AT.
El residuo que quedó después de la concentración de los extractos de acetato de etilo
reunidos se digirió luego en 2,5 ml de cada una de las fases superior e inferior de un
sistema disolvente que constaba denorte-hexano, acetato de etilo y fosfato potásico
acuoso 0,02 M (pH 8), 1:1:1 (vol/vol/vol), y sometidos a cromatografía a
contracorriente en una centrífuga Planet Coil multicapa Ito, con la fase superior
móvil. Luego se realizó una segunda separación con un sistema disolvente que
comprendenorte-hexano, acetato de etilo y fosfato potásico acuoso 0,02 M (pH 6,4),
6:4:5 (vol/vol/vol), con la fase superior móvil.
tarea completa del1Mano13Los espectros de C NMR de 10-desmetileritromicina A
6,9:9,12-espirocetal (10-desmetilanhidroeritromicina A) y 12-desmetil-12-
desoxieritromicina A fueron posibles con la ayuda de espectroscopia correlacionada,
correlación cuántica múltiple heteronuclear, enlace múltiple heteronuclear
correlación y mejora sin distorsión mediante experimentos de transferencia de
polarización.
Número de acceso a la secuencia de nucleótidos.La secuencia del dominio AT "Ven"
informada en este estudio tiene el número de acceso de GenBank. AF015823.
RESULTADOS
Dominios AT utilizados para reemplazar DEBS AT1 y DEBS AT2.
Tres dominios AT heterólogos, “Hyg” AT2, “Ven” AT y RAPS AT14,
cada uno de los cuales se cree que especifica el uso de malonil-CoA
para la extensión de la cadena de policétidos, en contraste con el
metilmalonil-CoA, que se usa para las condensaciones en la
biosíntesis de 6-dEB, fueron elegidos para reemplazar los dominios
AT de los módulos 1 (DEBS AT1) y 2 (DEBS AT2) de DEBS1 (10). El
dominio AT2 "Hyg" se obtuvo del módulo 2 del grupo de genes PKS
"Hyg" del productor de rapamicina.S. higroscópicoATCC 29253 (28).
RAPS AT14 se obtuvo del módulo 14 del grupo de genes PKS de
rapamicina (32) deS. higroscópicoATCC 29253 y se propuso
anteriormente para codificar un dominio AT específico de malonil-
CoA basado en la correlación de la estructura de la rapamicina con
la organización de su PKS (32). El dominio AT "Ven" se obtuvo de un
grupo de genes desconocido similar a PKS en el productor de
pikromicinaS. venezuelaeATCC 15439 como se describe en
Materiales y métodos. Las comparaciones de secuencias utilizando
la secuencia de aminoácidos deducida del dominio AT “Ven”
indicaron que está más estrechamente relacionado con el AT2 “Hyg”
y con los dominios AT de rapamicina que se cree que especifican
malonil-CoA como extensores (Fig. 2): 42 % idéntico a “Hyg” AT2 y 40
a 44% idéntico a los RAPS AT que son pre-
JBACTERIOL.
Se recomienda utilizar malonil-CoA como unidad extensora (32). Por
lo tanto, tanto “Hyg” AT2 como “Ven” AT también parecían ser
específicos para malonil-CoA, en base a su similitud con RAPS AT14 y
otros dominios RAPS AT que se pensaba que especificaban el uso de
malonil-CoA (Fig. 2). ).
Construcción de los plásmidos de reemplazo AT.Se desarrolló
una estrategia de casete para facilitar la construcción de varios
plásmidos, cada uno de los cuales alberga una AT heteróloga
diferente, para reemplazar DEBS AT1 o DEBS AT2. Dos sitios de
restricción únicos, AvrII ynsiI, se introdujeron en el casete utilizando
cebadores de PCR (Tabla 2 y Fig. 3). Los límites de los dominios AT
de eritromicina y heterólogos se definieron mediante la alineación
de la secuencia de aminoácidos de todos los dominios AT complejos
de PKS conocidos, y estos límites abarcan todas las regiones del
dominio AT que anteriormente se consideraban importantes para la
función AT (8). Los límites también se eligieron para tolerar la
introducción de nuevos sitios de restricción con un mínimo de
alteración de la secuencia de aminoácidos original de cada dominio
AT. Dentro de estas limitaciones, todos los dominios DEBS AT1 y
DEBS AT2 podrían reemplazarse cuandoAvrII ynsiLos sitios I se
introdujeron en los límites N y C-terminales, respectivamente.
Asimismo, los dominios AT heterólogos también estaban
flanqueados por estos sitios de restricción. Como se muestra en la
Fig. 3A, dos residuos cerca del extremo N (encuadrado) se
cambiaron a Pro (P) y Arg (R) introduciendo elAvrII sitio. En
particular, para los dos residuos cambiados en el extremo N, la P se
conserva en posiciones similares en todos los dominios AT de RAPS
(alineación no mostrada), y la R ya está presente en tres de los cinco
AT que se muestran en la Fig. 3A. En el extremo C, P (encuadrado) se
cambia a Ala (A) tras la introducción delnsiSitio I (Fig. 3A). La alanina
se encuentra naturalmente en esta posición en la secuencia original
del dominio AT "Ven".
Los casetes que transportaban ADN que flanqueaban los
dominios DEBS AT1 (EryAT1) y DEBS AT2 (EryAT2) residentes se
construyeron en varios pasos. Para la construcción del casete
flanqueante EryAT1 (Fig. 3B), el flanco aguas arriba se aisló de
pUC19/EryAT1/aguas arriba (Materiales y Métodos) y se insertó en el
ecológicoRHODE ISLAND/BamSitios HI de pUC19/EryAT1/aguas
abajo para generar flancos de pUC19/EryAT1 (mapa no mostrado). El
ecológicoRHODE ISLAND/HinLuego se aisló el fragmento dIII que
contenía ambas regiones flanqueantes en sus orientaciones
apropiadas de los flancos de pUC19/EryAT1 y se subclonó en los
mismos sitios de pWHM3 para generar el casete integrador
pWHM3/flanco de EryAT1 utilizado para el reemplazo del módulo 1
(Fig. 3B). Se tomaron medidas similares para preparar un segundo
casete integrador, pWHM3/EryAT2-flank, para el módulo 2 (Fig. 3B).
Se insertaron dominios AT heterólogos individuales entre las
dos regiones de ADN flanqueantes de los dominios DEBS AT1 o
AT2 como se muestra en la Fig. 3B. Los fragmentos de ADN
generados por PCR que portaban “Hyg” AT2, “Ven” AT y RAPS
AT14 se aislaron primero de los subclones correspondientes
(pUC18/“Hyg” AT2, pUC18/“Ven” AT y pUC19/RapAT14,
respectivamente) mediante digestión conAvrII ynsiI y luego
subcloné en el casete integrador pWHM3/EryAT1-flank para
generar tres plásmidos, pWHM3/EryAT1/“Hyg” AT2, pWHM3/
EryAT1/“Ven” AT y pWHM3/EryAT1/RapAT14, para reemplazos
de AT en el módulo 1 ( Figura 3B). Se tomaron pasos similares
para generar pWHM3/EryAT2/“Hyg” AT2 y pWHM3/EryAT2/
RapAT14 para reemplazos de AT en el módulo 2 (Fig. 3B).
Construcción de las cepas de reemplazo de AT deS. erythraea ER720.Los
dominios AT de los módulos 1 y 2 en DEBS1 deS. erythraeaER720 se
reemplazaron usando las construcciones descritas anteriormente que
contienen los diferentes AT heterólogos en un procedimiento de dos pasos
que implica la integración basada en homología de los plásmidos
recombinantes en el cromosoma deS. erythraea ER720, seguido de una
resolución basada en homología de la interfaz
VOL. 179, 1997 DERIVADOS DE ERITROMICINA VÍA DE SUSTITUCIONES 6421

HIGO. 3. Esquema de construcción de los plásmidos de sustitución AT. (A) Alineación de las secuencias de aminoácidos de los tres AT heterólogos y dos dominios AT
residentes que se van a reemplazar. Los residuos encuadrados que se muestran en los extremos N y C de los dominios AT se definieron como los límites para los reemplazos de
AT. Dos sitios de restricción únicos,AvrII (CCTAGG) ynsiI (ATGCAT), fueron introducidas en las regiones limítrofes. La introducción de laAvrEl sitio II provoca cambios de residuos a
P (Pro) y R (Arg) en el extremo N (como indican las flechas), y elnsiEl sitio I provoca un cambio a A (Ala) en el extremo C (como indica la flecha). (B) Los casetes de la región
flanqueante para los reemplazos de AT se construyeron como flanco pWHM3/EryAT1 para el módulo 1 y flanco pWHM3/EryAT2 para el módulo 2. Los números encima de cada
región flanqueante se refieren a las posiciones de secuencia relevantes en laeryAsecuencia depositada en GenBank (n.º de acceso M63676). Se aislaron tres fragmentos
generados por PCR que portaban las AT heterólogas de sus correspondientes subclones de pUC18/“Hyg” AT2, pUC18/“Ven” AT y pUC19/RapAT14 (ver Materiales y métodos)
mediante digestión conAvrII ynsiI y subclonados en pWHM3/EryAT1-flank o pWHM3/EryAT2-flank, respectivamente, para generar los plásmidos de reemplazo AT en el módulo 1
(pWHM3/EryAT1/“Hyg” AT2, pWHM3/EryAT1/“Ven” AT y pWHM3/EryAT1 /RapAT14) o módulo 2 (pWHM3/EryAT2/“Hyg” AT2 y pWHM3/EryAT2/RapAT14).

subvenciones para obtener los recambios deseados. Después de las
transformaciones de protoplastos con los plásmidos de reemplazo AT (;3metro
g de ADN plasmídico normalmente utilizado para cada transformación), de
uno a cinco ThiorNormalmente se obtuvieron transformantes integrativos. Se
verificó la integración del plásmido en el cromosoma.
mediante hibridación Southern usando la secuencia del vector pWHM3 o
la secuencia AT heteróloga como sonda (datos no mostrados). Luego se
utilizó un integrante de cada transformación para la resolución del
evento de integración. Comúnmente se obtuvieron de dos a seis
resolventes sensibles a tiostreptón a partir de
6422 RUAN ET AL. JBACTERIOL.

las resoluciones. Luego se sometieron a análisis Southern (datos TABLA 3. Datos de RMN para 12-desmetil-12-desoxieritromicina A
no mostrados) para determinar si la resolución daba como y 10-desmetileritromicina A 6,9:9,12-espirocetal en CDCl3
resultado el genotipo deseado en el que el dominio AT Cambio químico de RMNa
residente había sido reemplazado por el AT heterólogo. Las
13C
cinco cepas de AT reemplazadasS. erythraeaER720 obtenidos Posición 1h

fueron designadosS. erythraeaEryAT1/“Hyg” AT2,S. erythraea 1 2 1 2

EryAT2/“Hyg” AT2,S. erythraeaEryAT1/“Ven” AT,S. erythraea
EryAT1/RapAT14, yS. erythraeaEryAT2/RapAT14 (Tabla 1). 1 176,8 179.0
Nuevos derivados de eritromicina producidos por las 2 45.1 45,6 2.74 3.36
3 79,4 76.1 4.15 4.36
cepas de reemplazo de AT.Compuestos macrólidos producidos
4 41,7 42.1 2.01 2.09
por las cepas de reemplazo AT deS. erythraeaER720 se aislaron 5 83,5 85,4 3.58 3.42
como se describe en Materiales y Métodos y se caracterizaron 6 75.1 81,6
por TLC, TLC-bioautografía, MS y (paraS. erythraeaEryAT1/“Hyg” 7 38,7 41.2 1,91/1,66 2,13/1,46
AT2 yS. erythraeaEryAT2/“Hyg” AT2) Análisis de RMN. 8 43,7 39,8 2,86 2.14
Los reemplazos de AT en el módulo 1 (S. erythraeaEryAT1/ “Hyg” AT2,S. 9 219,5 115,5
erythraeaEryAT1/“Ven” AT, yS. erythraea EryAT1/RapAT14) parecen 10 46.1 42,5 2.70 2,56/2,38
producir el mismo derivado de eritromicina, según el análisis de TLC y MS 11 66,9 80.1 4.05 3.86
de extractos de caldo de cultivo. Como se muestra en la Fig. 5, este nuevo 12 40.3 83,9 1,71/1,46
13 73,7 81,6 5.06 5.18
compuesto es visible como una mancha teñida de azul que corre
14 28.0 24.2 1,61/1,56 2,00/1,66
ligeramente más rápido que la eritromicina A. El análisis de EM de estas
15-H3 9.6 10.9 0,89 0,84
muestras después del aislamiento de una placa de TLC reveló una M 2 canales3 14.4 13.6 1.19 1.09
dominante1h1pico enm/z 4 canales3 9.6 17.1 1.13 1.13
704, que es 30 unidades menor que para la eritromicina A (M1h1 6 canales3 26.3 27,7 1.38 1.41
5m/z734). Este resultado sugiere que estos compuestos son 8 canales3 18.5 12.0 1.19 0,90
derivados de eritromicina A que carecen tanto de un grupo metilo 10 canales3 10.6 1.11
como de un grupo hidroxilo. De acuerdo con los resultados de MS, 12 canales3 24,5 1.27
las principales especies de macrólidos producidos porS. erythraea 19 103.2 102.4 4.47 4.23
29 70,8 69,7 3.25 3.18
EryAT1/“Hyg” AT2 se caracterizó por su1Mano13Espectros de C NMR
39 65,4 65,8 2.49 2.52
como 12-desmetil-12-desoxieritromicina A (Tabla 3 y Fig. 4B).
49 28,9 28,7 1,69/1,26 1,68/1,25
Para determinar si la 12-desmetil-12-desoxieritromicina A es 59 69.2 69,4 3.54 3.49
biológicamente activa, los extractos del caldo de cultivo preparados a 69-h3 21.3 21.2 1.23 1.22
partir de las tres cepas de reemplazo de AT en el módulo 1 se sometieron norte(CH)3)2 40.3 40.4 2.30 2.30
a bioautografía por TLC. En todas las muestras analizadas se observó una 10 96,6 94,7 4.85 5.27
zona de inhibición única correspondiente a la posición del nuevo punto 20 34,9 34,6 2,40/1,59 2,27/1,53
de TLC (Fig. 5) (datos no mostrados). Este resultado indica que el nuevo 30 72,7 72,8
compuesto tiene una bioactividad significativa contraS. aureusy puede 40 77,9 78,3 3.03 2,98
50 66.0 65.0 4.04 3,98
ser el único macrólido biológicamente activo producido por estas cepas,
60-h3 18.4 17.8 1.29 1.18
ya que no se observó ninguna otra zona de inhibición incluso cuando se
30-CH3 21,5 21.6 1.25 1.20
aplicó una concentración 10 veces mayor de las muestras crudas (datos OCH3 49,5 49.3 3.33 3.26
no mostrados). Para comparar las cantidades de compuesto producido
aAsignaciones de desplazamiento químico de RMN para 12-desmetil-12-
por estas tres cepas, las células se cultivaron por triplicado, los extractos
desoxieritromicina A (1) y 10-desmetileritromicina A 6,9:9,12-espirocetal (2). La
se normalizaron para el crecimiento celular y la bioactividad de los
ausencia de13Señales C para el 12-CH3y 10 canales3en1y2, respectivamente, junto con
extractos diluidos en serie colocados en discos de bioensayo se midió las nuevas señales de metileno en C-12 (40,313C; 1,71/1,461H) en1y C-10 (42,5;
según el tamaño de la zona de inhibición frente aS. aureus. S. erythraea 2,56/2,38) en2indican que estos compuestos son los derivados esperados de
Se descubrió que EryAT1/“Hyg” AT2 produce aproximadamente de dos a desmetileritromicina.

cuatro veces más compuesto que cualquiera de los dos.S. erythraea

EryAT1/RapAT14 oS. erythraeaEryAT1/“Ven” AT.
Se llevaron a cabo caracterizaciones similares para las cepas de
reemplazo de AT en el módulo 2.S. erythraeaEryAT2/“Hyg” AT2 yS.
erythraeaEryAT2/RapAT14 parece producir los mismos derivados de
eritromicina, según el análisis de TLC y MS de extractos de caldo de
cultivo. Como se muestra en la Fig. 5, se identificaron mediante TLC
dos nuevos puntos, uno que corre ligeramente más rápido que la
eritromicina A y otro que corre ligeramente más lento que la
eritromicina A, en extractos de sobrenadantes de cultivo. El análisis
MS de las muestras reveló dos especies predominantes con el M1h1
masas moleculares dem/z720, correspondiente al anuncio TLC de
ejecución lenta, ym/z704, correspondiente al spot TLC de ejecución
rápida. Esto concuerda con los derivados de eritromicina A que carecen
de un grupo metilo y que carecen de un grupo metilo e hidroxilo,
respectivamente. Las estructuras predichas de estas dos derivadas se
muestran en la Fig. 4C. Además, se observó que la proporción de los dos
compuestos (determinada como la proporción de la altura del pico enm/z
720 a eso enm/z704) varió ligeramente con las condiciones de cultivo y/o
el proceso de extracción.
La bioautografía TLC del extracto crudo indica claramente
que ambos compuestos son biológicamente activos contraS.
aureus (datos no mostrados). A diferencia de la producción de
12-desmetil-12-desoxieritromicina A, el rendimiento de los
derivados de 10-desmetileritromicina porS. erythraea
EryAT2/“Hyg” AT2 no difirió significativamente del producido por
S. erythraea EryAT2/RapAT14. Además, como se muestra en la
Fig. 5, la producción de derivados de 10-desmetileritromicina
porS. erythraea EryAT2/“Hyg” AT2 yS. erythraeaEryAT2/RapAT14
parecía ser significativamente menor que el del derivado de 12-
desmetileritromicina, según las intensidades de los puntos de
tinción de TLC (Fig. 5).
Para estudios estructurales de RMN, los derivados de eritromicina
producidos porS. erythraeaEryAT2/“Hyg” AT2 se aislaron a partir de una
fermentación de 27 litros como se describe en Materiales y métodos.
Desafortunadamente, el compuesto esperado, 10-desmetileritromicina A,
no se recuperó con rendimiento suficiente para la determinación de la
estructura, pero sí se recuperaron varios miligramos de un presunto
producto de degradación, el derivado 6,9:9,12-espirocetal del 10-
VOL. 179, 1997 DERIVADOS DE ERITROMICINA VÍA DE SUSTITUCIONES 6423

HIGO. 4. Esquema que muestra los reemplazos de AT en el módulo 1 o 2 de DEBS y los compuestos producidos por las cepas de reemplazo. (A) Eritromicina A producida por tipo salvaje
S. erythraeaER720. (B) Derivado de eritromicina que carece del grupo metilo en el C-12 del anillo de macrolactona producido por cepas recombinantes deS. erythraeaER720 en el
que el dominio AT residente del módulo 1 fue reemplazado por tres AT heterólogas que especifican malonato en lugar de metilmalonato. (C) Derivados de eritromicina que
carecen del grupo metilo en el C-10 del anillo de macrolactona producidos por cepas recombinantes deS. erythraeaER720 en el que el dominio AT residente del módulo 2 fue
reemplazado por dos AT heterólogas que especifican malonato en lugar de metilmalonato. Abreviaturas: ACP, proteína portadora de acilo; kr,b-cetorreductasa; KANSAS,b-
cetoacil ACP sintasa; mmAT, metilmalonilo AT; mAT, malonilo AT; pAT, propionilo AT.

Se aisló desmetileritromicina A. Desde el1Mano13En los
espectros de C NMR de este compuesto, estaba claro que el
grupo metilo normalmente unido al C-10 estaba ausente y que
el metino C-10 había sido reemplazado por un metileno, como
se esperaba para un derivado de 10-desmetileritromicina (Tabla
3). Los datos del espectro de masas también coincidieron con la
asignación estructural, dando una M1h1ion enm/z702. Se sabe
que la eritromicina A puede convertirse en su derivado 6,9:9,12-
espirocetal en presencia de un ácido acuoso (42). Parece que la
10-desmetileritromicina A es incluso más lábil a tal
reordenamiento que el compuesto original.
DISCUSIÓN
La metilmalonil-CoA es la única unidad extensora utilizada por la
eritromicina PKS (DEBS) para construir el núcleo policétido de la
eritromicina. Para alterar la estructura principal del policétido, se
eligieron tres dominios AT heterólogos, “Hyg” AT2, RAPS AT14 y
“Ven” AT, que se predijo que usarían malonil-CoA, basándose en la
similitud de secuencia con otras supuestas aciltransferasas
específicas de malonil-CoA. reemplace el AT1 y
Dominios AT2 de la subunidad DEBS 1 de la eritromicina PKS.
Los AT heterólogos se aislaron de tres grupos de PKS diferentes
de dos grupos nosacaropolisporaactinomicetos. Uno de los tres,
RapAT14, se seleccionó del módulo 14 de la PKS de rapamicina
y, como se muestra en la Fig. 2, parece ser el menos conservado
entre los siete dominios de malonilaciltransferasa de
rapamicina. La elección de RapAT14 fue puramente arbitraria.
S. erythraealas cepas que portaban estos reemplazos de AT
heterólogos produjeron nuevos derivados de eritromicina que
carecen de un grupo metilo en la posición prevista en el anillo de
macrolactona. Los tres reemplazos de AT en el módulo 1 parecieron
producir el mismo derivado de eritromicina, 12-desmetil-12-
desoxieritromicina A (12-desmetileritromicina B).S. erythraea
EryAT1/“Hyg” AT2 produjo el nivel más alto del nuevo compuesto,
comparable al nivel de eritromicina A producido por la cepa
parental. Las otras dos cepas que portaban los reemplazos en AT1
produjeron menos 12-desmetil-12-desoxieritromicina A. Sin
embargo, se observaron rendimientos sustancialmente más bajos
cuando se reemplazó el AT en el módulo 2 de DEBS1: el nivel de 10-
desmetileritromicinas producidas por ambas
6424 RUAN ET AL.
HIGO. 5. Análisis TLC de los derivados de eritromicina producidos por cepas de
reemplazo de AT deS. erythraeaER720. El caldo de cultivo celular de las cepas de
reemplazo de AT en los módulos 1 y 2 se extrajo como se describe en Materiales y
métodos. Carril 1, cepa de tipo salvajeS. erythraeaER720; carriles 2 a 4, productores
de 12-desmetil-12-desoxieritromicina AS. erythraeaEryAT1/“Hyg” AT2,S. erythraea
EryAT1/RapAT14, yS. erythraeaEryAT1/“Ven” AT, respectivamente; carril 5, estándar de
eritromicina A (5metrogramo); carriles 6 y 7, productores de 10-desmetileritromicina
A y 10-desmetil-12-desoxieritromicina AS. erythraeaEryAT2/“Hyg” AT2 yS. erythraea
EryAT2/RapAT14, respectivamente. Las posiciones correspondientes a la eritromicina
A están indicadas por flechas.
S. erythraeaEryAT2/“Hyg” AT2 yS. erythraeaEryAT2/RapAT14 fue al
menos cinco veces menor que el nivel de eritromicina producida por
S. erythraeaER720. Dado que se produjeron niveles naturales de 12-
desmetileritromicina en al menos una de las construcciones AT1, la
base de las grandes variaciones en las tasas de síntesis no puede
atribuirse ni a la limitación de malonil-CoA para la incorporación ni a
la eficiencia del procesamiento de la naciente. policétido que carece
de cadena lateral en una sola posición. Más bien, es probable que
las grandes variaciones en las velocidades de síntesis estén
relacionadas con los efectos de la introducción de dominios
heterólogos en la estructura y funciones de los otros dominios en el
polipéptido multifuncional.
Los dominios AT aceptan la unidad extensora y la pasan al dominio
ACP dentro del módulo que ocupa. Aunque se puede permitir el
intercambio de dominios AT, pueden ocurrir efectos perjudiciales en las
tasas de transferencia de unidades extensoras cuando tienen lugar
interacciones AT-ACP no afines o supuestas AT-KS. Por lo tanto, las
grandes variaciones en los niveles de producción de policétidos
observadas cuando se usaron diferentes dominios AT heterólogos para
reemplazar un dominio AT residente determinado en el módulo 1 o 2 en
DEBS 1 no son inesperadas. Kuhstoss et al. (20) encontraron que cuando
los dominios AT-ACP del módulo iniciador (responsable de cargar la
unidad iniciadora en la síntesis de espiramicina) eran reemplazados por
una región correspondiente del módulo iniciador de la tilosina PKS, la
tasa de síntesis del policétido híbrido en realidad aumentó de tres a
cuatro veces. Por lo tanto, hasta que se comprendan las estructuras de
las PKS, no se puede predecir el efecto del intercambio de AT sobre la
tasa de síntesis de policétidos.
Estos efectos también pueden explicar los resultados observados
cuando se intentaron reemplazos utilizando los tres dominios AT de
malonilo heterólogos en otros módulos de DEBS. En resumen, las
cepas que portaban “Hyg” AT2 (el dominio que produjo el nivel más
alto de policétidos híbridos en los módulos 1 y 2) en los módulos 3,
4, 5 o 6 no produjeron niveles detectables de análogos de
eritromicina, ni tampoco otras cepas. llevando reemplazos usando
“Ven” AT o RapAT14 en módulos seleccionados (datos no
mostrados). Por lo tanto, es probable que se requiera más
información sobre la estructura del PKS antes de poder predecirlo.
JBACTERIOL.
a priori si un reemplazo modular determinado producirá niveles
productivos de nuevos policétidos.
También se han informado interacciones heterólogas productivas AT-
ACP en PKS aromáticas (19). Las PKS aromáticas están compuestas de
polipéptidos monofuncionales (o difuncionales) discretos que se
ensamblan para formar un complejo. En estos y posteriores
experimentos (24a), se sustituyó con éxito un ACP por otro. La mayoría
de los grupos de PKS aromáticas no contienen un gen que especifique
una función AT, pero dado que el malonato siempre se utiliza como
extensor en la síntesis de policétidos aromáticos, se cree que estas PKS
emplean el componente AT del complejo de ácido graso sintasa del
huésped (27a, 35). . Por lo tanto, las interacciones no relacionadas
aparentemente tuvieron lugar entre un ácido graso AT y una PKS ACP.
No fue sorprendente que la hidroxilación en el C-12 del anillo de
macrolactona, mediada por EryK, una enzima P450 (34), no tuviera
lugar en el derivado de 12-desmetileritromicina. La hidroxilación
mediada por P450 implica un mecanismo de radicales libres que
debería ser varios cientos de veces menos favorecido
energéticamente en el nivel secundario (-CH2-) carbono en lugar del
terciario [-CH(CH3)-] carbono que normalmente se encuentra en el
C-12 de la eritromicina. En los derivados 10-desmetilo,
aproximadamente la mitad de los compuestos estaban hidroxilados
en C-12. Dado que el nivel general de producción de 10-
desmetileritromicinas fue mucho menor que el nivel de eritromicina
producida por la cepa parental, el hallazgo de sólo un 50% de
hidroxilación sugiere una actividad de sustrato muy débil de 10-
desmetileritromicina D para EryK. (En la vía normal hacia la
eritromicina A, la eritromicina D se convierte en eritromicina C
mediante EryK: EryK purificado muestra una preferencia de 1.900
veces por la eritromicina D sobre la eritromicina B como sustrato
[21].) Curiosamente, no hay 12-desmetileritromicina D o 10 -Se
produjo desmetileritromicina C o D en cualquiera de las cepas de
reemplazo del dominio AT1 o AT2. Estos resultados indican que
EryG, la enzima queoh-metila el C0-3 hidroxilo en ell-micorosa,
puede utilizar eficientemente el derivado 10 o 12-desmetilo como
sustrato. Esto no podría haberse predicho ya que se descubrió
previamente que algunos derivados de eritromicina que contenían
cambios en la estructura del anillo de lactona, por ejemplo, 6-
desoxieritromicina, 2-desmetileritromicina yD6,7-anhidroeritromicina
C, tenían actividad reducida como sustratos para EryG (9, 24, 27, 40).
Oliynyk et al informaron por primera vez sobre el reemplazo de
un metilmalonilo con un extensor de malonilo en un policétido
mediante el intercambio del dominio AT1 de DEBS 1 con el dominio
AT del segundo módulo de la PKS de rapamicina. (26). Aunque ese
trabajo utilizó un sistema modelo DEBS 1 que produjo una lactona
tricétida, demostró sin ambigüedades que los dominios AT solos en
DEBS 1 (y probablemente todas las PKS complejas) especifican la
estructura de la unidad extensora incorporada durante la síntesis de
policétidos. Además, una comparación de todos los dominios AT en
la PKS de rapamicina con los que se describieron previamente para
DEBS permitió a Schwecke et al. (32) para demostrar que los AT
podrían agruparse en dos grupos según sus secuencias: los que
especifican malonato y los que especifican metilmalonato. Los
hallazgos aquí informados confirman y amplían el trabajo anterior al
demostrar que dos dominios AT en DEBS 1 pueden reemplazarse
por tres AT heterólogos diferentes que especifican malonilo. Sin
embargo, las secuencias distintivas propuestas por Haydock et al.
(12) para los AT que incorporan malonilo (ETGYAxxxxxxxQx-AxFGLL;
11 aminoácidos conservados) puede aplicarse solo a la PKS de
rapamicina. El dominio correspondiente en "Hyg" AT2 tiene solo
cuatro residuos conservados (rTdhAxxxxxxxexAxyrLw), y el dominio
AT "Ven" tiene solo tres residuos conservados
(rTvftxxxxxxxexsxFrLf). No obstante, los grupos de AT propuestos
por Schwecke et al. (32) son muy importantes. En dos de los tres
casos, la AT utilizada para el reemplazo en el módulo 1 o en el
módulo 2 de DEBS 1 era de un grupo de genes similar a PKS cuyo
 VOL. 179, 1997
El policétido correspondiente aún no se ha identificado. Por lo tanto, se
pueden realizar cambios en DEBS diseñados racionalmente con
componentes PKS no caracterizados o parcialmente caracterizados. Por
lo tanto, parece prometedor que se puedan producir policétidos
complejos novedosos y diseñados racionalmente mediante el ensamblaje
de componentes de PKS de una variedad de organismos con solo
información de secuencia para guiar la elección de los dominios AT.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos a T. Kavanaugh, L. Zulawinski y S. Nannapeneni por la
síntesis de oligonucleótidos, a J. Wang y K. Matuszak por el análisis de EM
y a D. Whittern y S. Malvar por los experimentos de RMN.
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