Biologia Molecular - ML - U4

Tecnología del ADN
Recombinante.
Material elaborado por:
Dra. Maria Celeste Vega Gomez
Campus Universitario
San Lorenzo, Paraguay
Universidad Nacional de Asunción
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Educación a Distancia
Índice
1. Introducción. ....................................................................................................................... 3
2. Tecnología del ADN Recombinante. Generalidades y definición. ...................................... 3
3. Obtención de Ácidos Nucleicos. ............................................................................................. 4
3.1. Extracción. .....................................................................................................................................4
3.2. Purificación. ...................................................................................................................................5
3.3. Cuantificación de ADN...................................................................................................................6
4. Enzimas o endonucleasas de Restricción. .............................................................................. 8
4.1. Generalidades ...............................................................................................................................8
4.2. Definición ......................................................................................................................................9
4.3. Tipos ..............................................................................................................................................9
4.3.1 Endonucleasas de restricción de Tipo I y Tipo III. .................................................................... 10
4.3.2 Endonucleasas de restricción de Tipo II. ................................................................................. 10
4.3.2.1. Extremos cohesivos o pegajosos......................................................................................... 11
4.3.2.2. Extremos abruptos o romos................................................................................................ 12
4.4. Nomenclatura............................................................................................................................. 12
5. Consideraciones Finales. ...................................................................................................... 13
Fuente de consulta. .................................................................................................................. 13
2 www.virtual.facen.una.py
1. Introducción.
Los conocimientos que hemos adquirido hasta este momento nos permitirán entender los
fundamentos de diferentes técnicas moleculares que empezaremos a desarrollar en las
siguientes unidades. Debemos recordar que todas las técnicas moleculares están basadas en
la “personalidad” físico-química o propiedad físico-química de la molécula, ya sea que
estemos hablando de un ácido nucleico o de una proteína.
En esta unidad y en la siguiente veremos la manera en que es posible realizar copias de

forma artificial de un fragmento de ADN de interés utilizando para ello un sistema in vivo.
2. Tecnología del ADN Recombinante. Generalidades y

definición.
El término ADN recombinante (ADNr) hace referencia a la creación de nuevas
combinaciones de segmentos o de moléculas de ADN que no se encuentran juntas de
manera natural. Este término se reserva a las moléculas de ADN producidas por la unión de
segmentos que provienen de diferentes fuentes biológicas.
Por lo tanto, el ADNr es una molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos
de ADN, y la tecnología del ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten
primeramente aislar el o los genes de interés de un organismo, para su posterior
manipulación e inserción en otro organismo diferente.
De esta manera podemos hacer que un organismo, ya sea animal, vegetal, bacteria u hongo
o un virus contengan un gen completamente extraño en su interior, y dentro de ese
organismo se podrá copiar el o los genes extraños o foráneos artificialmente introducidos.
El objetivo de la tecnología del ADN recombinante es obtener copiar de forma ilimitada de el

o los genes de interés por medio de un sistema in vivo. Veremos más adelante que también
existe otra técnica que nos permite copiar fragmentos de ADN pero de forma
completamente in vitro, es decir que no necesita ningún organismo vivo para clonar la
molécula de ADN.
Antes de continuar adentrándonos en la Tecnología del ADN Recombinante, lo primero que

debemos entender es como obtenemos el ADN con el que pretendemos trabajar.
3. Obtención de Ácidos Nucleicos.
La obtención de los ácidos nucleicos en general se basa en las características fisicoquímicas

de la molécula y el proceso de obtención de los ácidos nucleicos depende
fundamentalmente de la utilización posterior que se va a dar a la molécula y del tipo de
célula de la cual vamos a extraer.
A partir de los años 90 se introdujeron al mercado kits comerciales de extracción de ácidos

nucleicos que facilitan mucho más el proceso de extracción, pero en esta materia
estudiaremos los fundamentos del protocolo tradicional de obtención de los ácidos
nucleicos, centrándonos principalmente en el ADN.
3.1. Extracción.
El primer paso para obtener una molécula de ADN es modificar o destruir las moléculas que
conforman la pared celular, la membrana celular y nuclear permitiendo que los ácidos
nucleicos se liberen tras la ruptura (Fig. 1).
Para conseguir esto por lo general se utiliza una solución de lisis o buffer de lisis que está
preparada utilizando varios componentes. A continuación detallaremos los componentes de
un tipo de buffer de lisis comúnmente utilizado y las funciones de cada uno de ellos:
1- Buffer Tris-Acido Clorhídrico (Tris-HCl) a pH 8,0

La función del Tris-HCl a pH 8 es propiamente ser una solución tampón, amortiguador o
buffer manteniendo este pH, ya que las enzimas que destruyen el ADN (llamadas DNAsas)
actúan a pH más bajo y el ADN se mantiene estable a este pH.
2- Detergente no iónico
El detergente no iónico se utilizar para desnaturalizar las proteínas y así desestabilizar y
romper las membranas celulares y nucleares permitiendo que el ADN quede libre en la
solución. Habitualmente se utilizan los detergentes Duodecil sulfato de sodio (comúnmente
llamado SDS por sus siglas en inglés) o Tritón.
3- EDTA (Etilen diamino tetraacético)

El EDTA es un quelante, que significa que es una sustancia que forma complejos con iones, y
en este caso concretamente con cationes divalentes. Los cationes divalentes como el Mg+2 y
Ca+2 son cofactores de las DNAsas y son fundamentales para la actividad de estas enzimas.
De manera que el ETDA inhibe la actividad de estas enzimas “secuestrando” a sus
cofactores.
4- Cloruro de Sodio (NaCl)

El buffer de lisis también lleva NaCl a una concentración fisiológica previniendo de esta
forma la agregación de moléculas entre sí. Todas la moléculas se encuentran “cómodas” a
esta concentración, con la intención de preservar principalmente al ADN. Otra función del
NaCl es también remover los polisacáridos de la solución.
5- Proteinasa K
En muchas ocasiones en el proceso de lisis, se agrega también una solución de proteinasa K
que se utiliza para descompactar el ADN destruyendo las proteínas nucleares que están
unidas a él, y para destruir enzimas citoplasmáticas que degradan el ADN. La proteinasa K es
una serín proteasa que funciona correctamente a 55° C y no es dañada por los detergentes
no iónicos que se encuentran en el buffer de lisis. El tratamiento de una muestra con esta
proteasa incrementa la cantidad de ADN intacto que es extraído, sin embargo no todos los
protocoles de extracción lo utilizan porque es un reactivo costoso.
Los componentes celulares no solubles como el material fibroso y proteínas que

permanecen en solución se separan del ADN por centrifugación.
Figura 1: Extracción del ADN por lisis celular

Fuente: https://silo.tips/download/analisis-de-la-presencia-de-organismos-geneticamente-modificados-en-muestras-de--4
3.2. Purificación.
El siguiente paso en el proceso de obtención de ácidos nucleicos es la purificación, es decir

separar los ácidos nucleicos del resto de los componentes. Esta etapa se divide en 3 pasos
que detallaremos a continuación.
En el primer paso de purificación luego de la lisis celular es agregar una solución salina, por
lo general Acetato de Amonio, que neutraliza la carga (ya que esta es positiva) de los ácidos
nucleicos haciéndolas más afines entre si y también secuestra las moléculas de solvente (en
este caso agua) causando la agrupación de proteínas y restos celulares. Luego se centrifuga y
se genera un precipitado de todas las moléculas agrupadas (ya que son más pesadas)
quedando los ácidos nucleicos (ADN y ARN) en el sobrenadante. Este sobrenadante donde
se encuentran los ácidos nucleicos se pasa un nuevo tubo.
El segundo paso de la purificación es la precipitación selectiva, que consiste en agregar al

sobrenadante que se pasó al nuevo tubo, un alcohol llamado isopropanol. El ARN tiende a
mantenerse soluble en este solvente y el ADN precipita en una solución de isopropanol
mayor al 50%, y de ahí deriva el nombre de precipitación selectiva. Este paso permite limpiar
al ADN del ARN, ya que el ADN es insoluble en altas concentraciones de alcohol.
El tercer paso de la purificación es el lavado con otro alcohol llamado etanol. Como vimos
anteriormente el ADN precipita en alcohol (Fig. 2), y el etanol se utiliza para el lavado del
ADN con la finalidad de eliminar principalmente los excesos de sales disolviéndolas, ya que
las sales inhiben reacciones posteriores. Por lo general se utiliza etanol al 70% (y 30% de
H2O) y este proceso de lavado debe realizarse al menos dos veces para dejar al ADN lo más
puro posible. Después de los lavados, se seca el botón, lo que permite la evaporación del
alcohol (espontánea o acelerada en un desecador).
Figura 2: Lavado con etanol durante el proceso de obtención de ADN

Fuente: https://www.bioted.es/extraccion-y-purifcacion-de-acidos-nucleicos
3.3. Cuantificación de ADN.
Una vez extraído y purificado el ADN debemos determinar con que cantidad contamos y que
grado de pureza presenta la muestra con la que vamos a trabajar. Por lo general el método
más utilizado es el de la espectrofotometría, y para ello se utiliza un espectrofotómetro (Fig.
3), que permite medir a absorbancia (o densidad óptica, DO) de luz ultravioleta de
soluciones acuosas que contenga ADN, ya sea en forma diluida o sin diluir. Estas mediciones
se realizan en cubetas de 1 cm de espesor (Fig. 3).
Figura 3: Espectrofotómetro y cubeta utilizada para la cuantificación de ADN.

Fuente: http://rocioeevelyn.blogspot.com/2010/06/tarea-5a-establecer-y-describir-la.html
Debemos recordar que las estructuras anilladas absorben luz UV y el ADN concretamente lo
hace fuertemente a 260 nm de manera que se utiliza esta propiedad físico-química para
cuantificarla, de manera que a mayor absorbancia mayor cantidad de ADN.
Para determinar la concentración de ácidos nucleicos se utiliza la siguiente fórmula:

Concentración del ácido nucleico (µg/mL)= Absorbancia260 x Factor de Conversión x Factor Dilución
Para convertir las unidades de absorbancia en unidades de concentración, expresadas en

microgramos por mililitro (µg/mL) se multiplica la absorbancia obtenida a 260 nm (que es el
valor que da espectrofotómetro) por un factor de corrección que es distinto según el tipo de
ácido nucleico que se pretende analizar. A continuación observamos los valores para cada
tipo de acido nucleico.
TIPO DE ACIDO NUCLEICO FACTOR DE CORRECCION

ARN cadena sencilla 40 µg/ml
ADN cadena sencilla 35 µg/ml
ADN doble cadena 50 µg/ml
Finalmente dentro de la fórmula también se encuentra el factor de dilución, que se utiliza

solo en el caso que la muestra haya sido diluida. El número que se utiliza varía de acuerdo a
la cantidad de veces que se ha diluido una muestra, por ejemplo si fue de 10 veces (1µl de
solución de ADN + 9 µL de H2O) se multiplica por 10 y se fue de 50 veces (1µl de solución
de ADN + 49 µL de H2O) de multiplica por 50. Las muestras que se diluyen son muestras en
las que se obtienen grandes cantidades de ADN y el espectrofotómetro no puede cuantificar
por lo que necesita diluirlas.
Es importante tener en cuenta que pueden existir múltiples contaminantes que queden tras
la extracción/purificación y que interfieren en la cuantificación. Es por ello que
habitualmente la interferencia con los contaminantes (principalmente proteínas) se calcula

utilizando un «cociente». Dado que las proteínas absorben a 280 nm, se emplea el cociente
A260/A280 para calcular la pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes respectivos cuando
están en estado puro son aproximadamente para el ADN a 1,8 y para el ARN a 2,0.
El ADN puede conservarse por periodos cortos a temperatura ambiente o a 4° C, pero para
largos periodos de conservación lo ideal es mantenerlo congelado a -20° C, -80° C o en
nitrógeno líquido (-196° C).
Una vez obtenido del ADN, la pregunta siguiente sería: ¿Para qué extraemos ADN?
La respuesta a esta pregunta es: para producir posteriormente grandes cantidades de
ADN o dicho de otra forma CLONAR ADN
Un punto sumamente importante antes de continuar, es comprender que la clonación de

ADN consiste en realizar muchas copias idénticas de un fragmento de ADN específico, y que
NO es lo mismo, que la clonación de un organismo, que implica producir copias genéticas
idénticas de un individuo específico. En esta materia nos centraremos específicamente en la
clonación de ADN.
La técnica de ADN Recombinante que estudiaremos se utiliza para clonar ADN, y es una
herramienta para la comprensión de la estructura, función y regulación de los genes y sus
productos.
El ADN obtenido es muy grande para trabajar con el, de manera que hay que fragmentarlo.
Esta fragmentación puede realizarse de forma no controlada por ruptura mecánica o bien de
forma controlada utilizando enzimas de restricción.
4. Enzimas o endonucleasas de Restricción.

4.1. Generalidades
Las enzimas de restricción actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material
genético extraño que entra en la célula bacteriana. Este material genético proviene de
bacteriófagos que son virus que infectan a las bacterias. Las bacterias tienen la capacidad de
metilar su ADN, gracias a una enzima llamada metilasa, permitiendo de esta forma distinguir
entre el ADN extraño y el ADN propio. Las enzimas de restricción solo atacan secuencias no
metiladas y este sería un mecanismo de defensa con que cuentan las bacterias que
funcionarían como un “sistema inmunológico” primitivo.
Estas enzimas fueron descubiertas en los años 60s y su uso en biología molecular empezó en
los 70s. En 1971, un artículo publicado por Kathleen Danna y Daniel Nathans revolucionó la
Biología Molecular y marcó el inicio de la era del ADN recombinante. Este artículo describe el
aislamiento de una enzima de una cepa bacteriana y la utilización de esta enzima para cortar
DNA vírico en secuencias nucleotídicas específicas.
4.2. Definición
Las enzimas que degradan o digieren los ácidos nucleicos se denominan nucleasas y si ellas
específicamente degradan ADN se las llama ADNsas o DNAsas.
Las endonucleasas o enzimas de restricción son proteínas que reconocen una secuencia
específica interna de una molécula ADN (Fig. 4) y luego rompen enlaces fosfodiéster en las
dos cadenas.
Figura 4: Enzimas de restricción o tijeras moleculares

Fuente: http://www.fernandotuya.org
En la jerga de la biología molecular a este proceso de romper los enlaces covalentes se lo

denomina habitualmente “cortar” el ADN, por eso también reciben el nombre de tijeras
moleculares (Fig. 5).
Figura 5: Enzimas de restricción o tijeras moleculares

Fuente: http://www.fernandotuya.org
4.3. Tipos
En la naturaleza las bacterias tienen 3 tipos de endonucleasas de restricción: Tipo I, Tipo II y

Tipo III. A continuación detallaremos las características de cada una de ellas.
4.3.1 Endonucleasas de restricción de Tipo I y Tipo III.
En las endonucleasas de restricción de Tipo I y III no hay un control estricto sobre la posición
precisa de corte respecto a la secuencia específica de ADN que reconocen. Dicho en otras
palabras, reconocen una secuencia específica pero se mueven y cortan en otro sitio. Por lo
tanto estas enzimas son menos útiles porque no se conocen con precisión la secuencia de los
fragmentos resultantes. Además son enzimas bifuncionales como veremos a continuación.
Las características de estos dos grupos de enzimas son las siguientes:
a. Tienen una subunidad con actividad de restricción, es decir cortan los enlaces fosfodiéster.
b. Tienen una subunidad con actividad de metilación para proteger su ADN de la acción de
restricción.
c. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento. Las de Tipo I cortan lejos de
la secuencia de reconocimiento (entre 100 a 1000 pb), ya sea antes o después de esta
secuencia. Las de Tipo III cortan entre 5 a 25 pb antes o después de la secuencia que
reconocen.
d. Necesitan Mg+2 como cofactor y ATP para moverse a través de la molécula de ADN desde
el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
4.3.2 Endonucleasas de restricción de Tipo II.
Cada enzima de restricción de Tipo II corta siempre dentro de su secuencia de

reconocimiento y en el mismo lugar, haciéndolas sumamente útiles para utilizarlas en la
clonación de ADN.
Las características de este grupo de enzimas son las siguientes:

a. Sólo tienen actividad de restricción, es decir solo pueden cortar el ADN.
b. Cortan en el interior de la secuencia de reconocimiento y siempre en el mismo sitio. La

secuencia de reconocimiento va de 4 a 8 pares de bases dependiendo de la enzima.
c. Sólo requieren Mg+2 como cofactor y no necesitan ATP, ya que una vez que reconocen su
secuencia cortan dentro de ella.
f. Cortan en secuencias palindrómicas, que para el caso de doble cadena son secuencias
idénticas en ambas cadenas leídas de 5' a 3'. Recordar que las cadenas de ADN son
antiparalelas entre sí.
A continuación en la Fig. 6, una serie de enzimas de Tipo II donde puede observarse la

secuencia de reconocimiento (cada enzima tiene una secuencia de reconocimiento
especifica), que todas ellas son regiones palindrómicas y que el sitio de corte de cada enzima
se mantiene siempre (indicado con una flecha). Aprovecen los ejemplos a continuación para
comprender a los palíndromos de doble cadena.
Figura 6: Algunas enzimas de restricción tipo II con sus secuencias de reconocimiento.

Fuente: https://www.e-allscience.com/blogs/news/que-son-las-enzimas-de-restriccion-para-que-se-usan-y-que-funcion-desempenan-en-
la-naturaleza
Las enzimas de restricción de Tipo II pueden generar dos tipos de extremos cuando cortan el
ADN. A continuación veremos cada uno de ellos:
4.3.2.1. Extremos cohesivos o pegajosos.
Las enzimas de restricción de Tipo II que generan extremos cohesivos cortan el ADN en dos
puntos diferentes y a distinto nivel en cada hélice de ADN, es decir hacen un corte
asimétrico. Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden
unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de
restricción, por ser compatibles entre sí o volver unirse consigo misma por la formación de
puentes de hidrogeno.
A su vez los extremos cohesivos o pegajosos generados por algunas enzimas de restricción
de tipo II pueden tener dos tipos de salientes
a) Saliente hacia 5’: la enzima corta asimétricamente dentro del sitio de reconocimiento de
tal manera que un corto segmento de cadena sencilla se extiende desde el extremo 5' de
cada cadena (Fig. 7).
Figura 7: Extremo cohesivo saliente hacia 5’

Fuente: http://martinezcarlos.weebly.com/
b) Saliente hacia 3’: la enzima corta asimétricamente dentro del sitio de reconocimiento de tal
manera que un corto segmento de cadena sencilla se extiende desde el extremo 3' de cada cadena
(Fig. 8).
Figura 8: Extremo cohesivo saliente hacia 3’

4.3.2.2. Extremos abruptos o romos.
Las enzimas de restricción de Tipo II que generan extremos romos cortan a la misma altura
en las dos hélices de ADN. Este tipo de enzimas no dejan extremos salientes como se
observa en la Figura 9.
Figura 9: Extremo cohesivo romo

4.4. Nomenclatura
Las endonucleasas o enzimas de restricción se nombran a partir de las bacterias de las que
son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se
aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las
próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa (variante antigénica de la
bacteria), y un número romano al final indica la posición de aislamiento en esa cepa, en caso
de que se hayan encontrado varias enzimas con distinta especificidad en la misma bacteria.
Ejemplo:
Eco RI  E = género Escherichia
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
5. Consideraciones Finales.
En esta Unidad hemos visto primeramente la manera en la que obtiene la molecula que sera
la base para todo el porceso del desarrollo del ADN recombinante, y seguidamente
estudiamos en detalle la principal herramienta que permitio el desarrollo de la tecnoclogia
del ADN recombinante. Estos conocimientos serán la base para comprender el proceso de
clonación in vivo que veremos en la siguiente unidad.
Fuente de consulta.
Luque, J. y Herráez, A. (2001). Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética.
Conceptos Técnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud. Harcourt.

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En esta unidad y en la siguiente veremos la manera en que es posible realizar copias de

2. Tecnología del ADN Recombinante. Generalidades y

El objetivo de la tecnología del ADN recombinante es obtener copiar de forma ilimitada de el

Antes de continuar adentrándonos en la Tecnología del ADN Recombinante, lo primero que

3. Obtención de Ácidos Nucleicos.

La obtención de los ácidos nucleicos en general se basa en las características fisicoquímicas

A partir de los años 90 se introdujeron al mercado kits comerciales de extracción de ácidos

1- Buffer Tris-Acido Clorhídrico (Tris-HCl) a pH 8,0

3- EDTA (Etilen diamino tetraacético)

4- Cloruro de Sodio (NaCl)

Los componentes celulares no solubles como el material fibroso y proteínas que

Figura 1: Extracción del ADN por lisis celular

El siguiente paso en el proceso de obtención de ácidos nucleicos es la purificación, es decir

El segundo paso de la purificación es la precipitación selectiva, que consiste en agregar al

Figura 2: Lavado con etanol durante el proceso de obtención de ADN

3.3. Cuantificación de ADN.

Figura 3: Espectrofotómetro y cubeta utilizada para la cuantificación de ADN.

Para determinar la concentración de ácidos nucleicos se utiliza la siguiente fórmula:

Para convertir las unidades de absorbancia en unidades de concentración, expresadas en

TIPO DE ACIDO NUCLEICO FACTOR DE CORRECCION

Finalmente dentro de la fórmula también se encuentra el factor de dilución, que se utiliza

habitualmente la interferencia con los contaminantes (principalmente proteínas) se calcula

Un punto sumamente importante antes de continuar, es comprender que la clonación de

4. Enzimas o endonucleasas de Restricción.

Figura 4: Enzimas de restricción o tijeras moleculares

En la jerga de la biología molecular a este proceso de romper los enlaces covalentes se lo

Figura 5: Enzimas de restricción o tijeras moleculares

En la naturaleza las bacterias tienen 3 tipos de endonucleasas de restricción: Tipo I, Tipo II y

4.3.1 Endonucleasas de restricción de Tipo I y Tipo III.

Las características de estos dos grupos de enzimas son las siguientes:

4.3.2 Endonucleasas de restricción de Tipo II.

Cada enzima de restricción de Tipo II corta siempre dentro de su secuencia de

Las características de este grupo de enzimas son las siguientes:

b. Cortan en el interior de la secuencia de reconocimiento y siempre en el mismo sitio. La

A continuación en la Fig. 6, una serie de enzimas de Tipo II donde puede observarse la

Figura 6: Algunas enzimas de restricción tipo II con sus secuencias de reconocimiento.

4.3.2.1. Extremos cohesivos o pegajosos.

Figura 7: Extremo cohesivo saliente hacia 5’

Figura 8: Extremo cohesivo saliente hacia 3’

4.3.2.2. Extremos abruptos o romos.

Figura 9: Extremo cohesivo romo

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