Universidad Nacional de Piura
Facultad de Ingeniería Industrial
Escuela Profesional de Agroindustrias
Informe de laboratorio
Materia:
Biotecnología
Tema:
Extracción de pectina de la cascara de mandarina
Ciclo Académico:
2019-1
Docente:
Blgo: Jorge Bermejo
Integrantes:
Condolo Vásquez María Diana
Huaman Elera Elizabeth Clorinda
Yovera Mío Karla
Piura – 2019
Contenido
I. Introducción ........................................................................................................... 1
II. Objetivos ............................................................................................................ 3
Objetivo General: ......................................................................................................... 3
Objetivos Específicos: ............................................................................................. 3
III. Marco Teórico .................................................................................................... 4
IV. Materiales ......................................................................................................... 12
4.1. Materiales ................................................................................................. 12
1.1. Material biológico ................................................................................. 12
1.2. Material de laboratorio y/o campo ........................................................ 12
V. Metodología ..................................................................................................... 13
VI. Resultados ........................................................................................................ 15
VII. Discusiones................................................................................................... 15
VIII. Conclusiones ................................................................................................ 16
IX. Recomendaciones ............................................................................................ 17
X. Bibliografía ...................................................................................................... 18
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I. INTRODUCCIÓN
El Ácido desoxirribonucleico (ADN), es el material genético de todos los
organismos vivos y de casi todos los virus. Es el ADN quien lleva la
información necesaria para dirigir la síntesis de proteínas y la duplicación de
la misma molécula. Esta biomolécula fue detectada en el núcleo celular por el
investigador F. Miesher en 1869, y desde los años 40 O. Avery y sus
colaborados descubrieron que el material genético está formado de ADN. En
las últimas décadas, la Biología se ha enriquecido con una variedad de técnicas
que han permitido la posibilidad de entender con mayor precisión, estructuras,
funciones, mecanismos o fenómenos de los sistemas vivos. La manipulación
del ADN, es uno de los ejemplos más espectaculares del avance de la aplicación
de una serie de herramientas, que anteriormente no se contemplaban en el
campo científico y que en la actualidad, se usan de manera rutinaria para
desarrollar una amplia variedad de estudios genéticos. Para estudiar el ADN es
imprescindible aislarlo e identificarlo. Existen diferentes métodos de
aislamiento, dependiendo del tipo de estudios o investigación que se quiera
realizar. Sin embargo todos comparten el hecho de que, debido a que la
molécula se encuentra al interior de estructuras membranosas y está asociada
con proteínas, se requiere usar sustancias adecuadas para obtener al ADN de la
forma más purificada posible. La técnica utilizada en esta actividad
experimental, se basa por un lado, en el principio de que el componente
fundamental de las membranas plasmática y nuclear, son los lípidos, por lo cual
se utiliza un detergente (surfactante) para romper estas estructuras y permitir la
salida del ADN. Por otro lado, el ADN de vegetales y animales se encuentra
asociado a proteínas de tipo histona, por lo tanto, al agregarle alcohol se
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precipitan las proteínas y de esta forma se obtiene al ADN como una estructura
más pura. Finalmente, se conoce que el ADN es una molécula de carácter ácido,
lo que le permite ser identificada con colorantes específicos como el anaranjado
de acridina
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II. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:
Efectuar la técnica de extracción y aislamiento de ADN en hígado de
pollo para visualizar el aspecto real de este tipo de ácido nucleico.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Diferenciar entre el Modelo del ADN propuesto por Watson y Crick y
el aspecto real del ácido desoxirribonucleico extraído por esta técnica.
Comprender que esta técnica, es sólo el inicio de otras que se aplican
en el ámbito científico para resolver problemas de genética humana y
mejoramiento de razas y variedades.
Profundizar la comprensión de conceptos relacionados con la Ingeniería
genética y sus aplicaciones y promover el desarrollo de habilidades y
destrezas.
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III. MARCO TEÓRICO
La extracción de ADN se realiza para obtener las moléculas aisladas con
alto grado de pureza y poderlas utilizar en investigación científica, en medicina
o para la ciencia forense. La mayor parte de los métodos que existen para
extraer el ADN consisten en lograr primero la lisis o ruptura de la célula, para
luego separar las moléculas de ADN del resto de los constituyentes de la célula.
A la hora de escoger que método de extracción de ADN utilizar se tienen en
cuenta varios factores:
La cantidad de muestra de la que se dispone para extraer el ADN.
El tipo de muestra o fuente de la que se quiere obtener el ADN.
La pureza con la que se quiere obtener el ADN extraído.
El tiempo que consume cada método, su costo y el rendimiento
esperado.
Uso que se le va a dar al ADN extraído.
Con la diversidad de métodos conocidos actualmente se puede extraer ADN
de muchos sustratos como son la sangre, la saliva, la orina y otros fluidos
corporales, tejidos vivos, cultivos celulares, líquido amniótico, entre otros. En
este trabajo se analizan las diferencias, ventajas y desventajas de algunos de los
métodos existentes para la extracción del ADN.
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Incubación del lisado para su uso
Una posible forma de aislar el ADN genómico es incubar el lisado crudo a
temperaturas entre 90 – 100 ºC y luego usarlo directamente. Es evidente que
mediante este método el ADN obtenido es de muy baja pureza y con
aplicaciones muy reducidas. Otra desventaja de este método son las pérdidas
de ADN por acción de las nucleasas y otros componentes de los orgánulos que
están en contacto con el ADN y pueden destruirlo, por lo que no es útil para
almacenar el ADN pues los contaminantes pueden degradar las moléculas de
ADN.
Lisis por ruptura mecánica y extracción con disolventes orgánicos
Si se opta por realizar el lisado de las células mediante un proceso mecánico
hay que tener en cuenta la posibilidad de ruptura de las moléculas de ADN que
se intentan separar, por lo que este debe bastar para lograr la lisis de las células
pero no ser muy agresivo para proteger el ADN. Este método puede ser usado
para extraer ADN de material crudo, liofilizado o congelado, que puede
romperse con un mortero, por congelación-descongelación o usando
ultrasonidos. El lisado de células se puede extraer con cloroformo, alcohol
isoamílico o fenol, siendo las proteínas y otros componentes de la célula
solubles en el disolvente orgánico, por lo que de esta forma se logra la
separación de los ácidos nucleicos. Este método se puede usar para moléculas
de ADN de alto peso molecular, obteniendo buenos rendimientos de moléculas
relativamente puras, siempre teniendo en cuenta que hay que controlar el pH
de la fase acuosa y la concentración de sales, que son los factores que aseguran
una buena separación. Las desventajas de este método son el uso de disolventes
orgánicos dañinos para la salud humana y que pueden quedar como trazas en
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la muestra de ADN y luego actuar como interferentes en técnicas como el PCR,
que es largo, en ocasiones puede dar rendimientos poco reproducibles y
requiere de varios trasvases que aumentan la posibilidad de contaminación de
la muestra.
Lisado y purificación con un detergente iónico. Método del CTAB
Este es un procedimiento básico para extraer ADN de vegetales, donde un
detergente aniónico puede romper la pared celular y así se produce la lisis de
las células. El uso de detergentes aniónicos no solo se restringe a la extracción
de ADN vegetal, puede ser usado para ADN genómico de bacterias y otros
tipos de organismos. Un ejemplo de este método, quizás el más conocido, es el
uso de CTAB (bromuro de cetil trimetil amonio) como detergente para lograr
la lisis. El CTAB además, en presencia de EDTA como agente quelatante y
TRIS-HCl como tampón, forma complejos insolubles con el ADN. Luego se
extraen los residuos orgánicos con cloroformo, para separar posteriormente el
ADN por precipitación con etanol. Si se quiere evitar el uso de disolventes
orgánicos se puede llevar a cabo el método del CTAB separando directamente
los complejos insolubles formados con el ADN del sobrenadante donde han
quedado disueltos el resto de componentes celulares. Estos complejos se
resuspenden en disolución salina y se adiciona posteriormente alcohol y
RNAsa, logrando que precipite el ADN con un grado de pureza aceptable para
muchas aplicaciones.
Método de salting-out
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A partir de un lisado celular se pueden separar las moléculas de proteínas
y otros contaminantes del ADN mediante la adición de altas concentraciones
de sal que hacen que disminuya la solubilidad de las moléculas orgánicas en la
fase acuosa. En este método se utiliza frecuentemente la proteinasa K, el TRIS-
HCl para regular el pH y otros reactivos químicos que aseguren la total
inactivación de las enzimas que pueden actuar sobre las moléculas de ADN.
Para la extracción se utilizan sales inorgánicas como el perclorato de sodio
y el cloruro de sodio en concentraciones muy altas que hacen precipitar a las
moléculas orgánicas. El precipitado formado se separa por centrifugacón y
luego se puede extraer el ADN de la disolución acuosa mediante la adición de
alcohol, por precipitación.
Este método es sencillo, pero no siempre es eficaz, por lo que el ADN
obtenido en muchas ocasiones debe ser purificado antes de ser usado en
posteriores aplicaciones. La ventaja es que se elimina el uso de disolventes
orgánicos.
Uso de la proteinasa K y el dodecilsulfato de sodio
El procedimiento conocido como PK-SDS por sus siglas en inglés
proteinase K - sodium dodecyl sulfate, es uno de los más usados para la
extracción de ADN ya que la digestión de la muestra se puede realizar con
proteinasa K que es activada por el dodecil sulfato de sodio. La proteinasa K
inactiva las DNAsas presentes en el lisado celular usando detergente aniónico
el SDS. La proteinasa K también es usada en otros de los métodos descritos en
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este artículo para la digestión de las proteínas y otros contaminantes del lisado
celular.
Método de extracción de ADN con yoduro de sodio como agente caotrópico
en un único tubo
La compañía Wako pone a disposición de los investigadores y empresas
varios kit de ADN que usan yoduro de sodio como agente caotrópico, que
tienen la ventaja de que la extracción se realiza en un único micro tubo de
centrifugado. El yoduro de sodio además de provocar la lisis celular rompe la
capa de hidratación que rodea el ADN y logra que las cargas negativas de los
grupos fosfatos del ADN queden más expuestas. En estos kits después del
tratamiento de la muestra con yoduro de sodio en el mismo tubo se adicionan
detergentes aniónicos como es el caso del N-lauril sarcosinato de sodio,
proteinasa K y/o otros reactivos que permiten separar las proteínas y lípidos
contenidos en las muestras biológicas del ADN.
El conocimiento del ADN, su estructura y función fue crucial para el
progreso de la biotecnología moderna. El ADN o ácido desoxirribonucleico, es
una base de datos en la cual está contenida toda la información e instrucciones
que determinan la forma y características de un organismo y sus funciones. Es
responsable además, de la transmisión de estas características a través de la
reproducción gracias a su poder de replicación, constituyendo la base de la
herencia. Después que la comunidad científica comprendiera la estructura de
los genes y cómo se traduce la información que estos portan, iniciaron la carrera
en la búsqueda de cómo estudiarlos, aislarlos, modificarlos y transferirlos entre
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organismos. De esta forma nació la ingeniería genética y con ella la clonación,
revolucionando así la biotecnología moderna. La clonación es la multiplicación
de fragmentos de ADN para expresar genes en organismos diferentes al de
origen. Así, es posible obtener proteínas de interés en organismos diferentes
del original del cual se extrajo el gen, mejorar cultivos y animales, obtener
nuevos fármacos, entre otras aplicaciones.
Gracias al estudio del ADN se puede, además, conocer cuáles enfermedades
se tiene el riesgo de padecer; descubrir al autor de un crimen; identificar restos
humanos; verificar la paternidad; o hasta diseñar un tratamiento contra el
envejecimiento a medida.
En las investigaciones de enfermedades como el cáncer, un avance
relativamente reciente es el análisis del ADN tumoral circulante (ctDNA),
basado en el ciclo de vida natural del tumor. El ctDNA son pequeñas porciones
de ADN de las células tumorales que portan los marcadores genéticos del tumor
y que se liberan al torrente sanguíneo. Actualmente es posible detectar
mutaciones genéticas con solo una muestra de sangre, mediante la
identificación y análisis del ctDNA. De esta manera se cuenta con una
alternativa importante a las biopsias, el método tradicional de análisis de
mutaciones que requieren la extracción invasiva de tejido o células del área
tumoral.
Como podemos ver, contar con técnicas de extracción del ADN cada
vez más eficientes y de fácil aplicación es un objetivo clave en el universo
científico. En anteriores artículos, hemos comentado sobre 10 métodos
existentes para la extracción de ADN, los factores a tener en cuenta a la
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hora de la selección del método, así como las principales características de
cada uno.
Entre ellos, la extracción de ADN con yoduro de sodio como agente
caotrópico es el método seleccionado por la compañía distribuidora de
reactivos químicos para la investigación, Wako Chemicals, para
desarrollar una serie de equipos con este fin. Este método aventaja en
cuanto a su elevado rendimiento, la sencillez del procedimiento ya que se
realiza en un único microtubo de centrifugado, la seguridad de la operación
al evitar solventes tóxicos como el fenol y/o cloroformo, así como por la
reducción de la contaminación en la muestra. Algunos de los packs de
reactivos para la extracción de ADN se describen a continuación: Mediante
el equipo extractor de ADN SP, de Wako, es posible extraer fragmentos
de ADN contenidos en el suero sanguíneo y en el plasma, incluso de
muestras muy pequeñas, con un alto rendimiento y poca variabilidad.
En el caso del aislamiento del ADN a partir de cortes y muestras de tejidos
parafinados y congelados, el equipo aislador de ADN PS permite el aislado en
un tiempo reducido con la mínima pérdida de material genético, gracias a que
todas las manipulaciones del método se pueden realizar en un solo tubo. Las
muestras después del aislamiento pueden ser utilizadas para la amplificación
del ADN.
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La introducción de la tecnología del ADN en la investigación médico
forense ha supuesto un invaluable avance tanto en la investigación biológica
de la paternidad, como en la investigación criminal, posibilitando el estudio de
indicios biológicos mínimos. El equipo de extracción de ADN FM,
desarrollado por Wako ofrece un procedimiento rápido para aislar el ADN de
materiales rígidos (vello, uñas, manchas de saliva, de sangre y otros fluidos
corporales), que contienen cantidades limitadas de ADN.
El biomarcador 8-OHdG ha sido un marcador fundamental para medir el
efecto del daño oxidativo endógeno al ADN, como factor de iniciación y
promoción de la carcinogénesis y también como un factor de riesgo para
muchas otras enfermedades. El equipo DNA extractor® TIS es el equipo de
extracción del ADN más útil para la detección y determinación del 8-OHdG.
Además, está diseñado especialmente para la extracción de ADN de tejido
parenquimatoso humano y animal. Logra la inhibición de la oxidación posterior
del ADN mediante un inhibidor de la oxidación.
El Extractor de ADN WB, constituye una herramienta potente para la
extracción de ADN genómico a partir de sangre completa, cultivos celulares y
cultivos tisulares. Emplea un procedimiento simple de extracción, con alta
eficiencia, para el aislamiento de ADN intacto de alta pureza.
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IV. MATERIALES
4.1. MATERIALES
1.1. Material biológico
Hígado de pollo fresco
Agua helada
1.2. Material de laboratorio y/o campo
Mortero
Vaso precipitado
Probeta
Pipeta
Propipeta
Alcohol isoprópilico
Estereoscopio
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V. METODOLOGÍA
1. Triturar en un mortero 10 gr de hígado de ave más 10 gr de sal de cocina
más 100 ml de agua helada.
2. Filtrar el contenido anterior, 20 ml de detergente líquido, reposar por
10 minutos.
3. Dejar reposar hasta formar un precipitado.
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4. Tomar 10 ml del líquido sobrenadante y adicionar alcohol isoprópilico
frio, 30 ml, al tubo de ensayo base.
5. Observar la precipitación del ADN en la interfase agua-alcohol, hilos
blancos.
6. Observar al estereoscopio, pinza o aza de siembra, se coloca en una
placa Petri y se observa.
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VI. RESULTADOS
Resultados se presentan en el laboratorio siguiente:
Gracias a todos los pasos seguidos en la práctica se logró observar
fragmentos resplandecientes ADN.
VII. DISCUSIONES
Los resultados que obtuvimos fueron muy positivos ya que se logro la
obtención del ADN con la realización de todos los pasos antes descritos, lo
cual podemos decir que fue un método muy eficiente, las complicaciones que
pudimos observar fueron solo de tiempos entre unos equipos, de realización de
los procedimientos además que en la obtención del ADN muchos obtuvieron
gran cantidad de muestra y se facilito su extracción del tubo pero se puede decir
que se cumplió el objetivo de extracción de ADN de un hígado de pollo.
Mediante el procedimiento experimental se obtuvo el ADN de los vegetales,
pudiendo observar su forma; lo cuales confirman o reafirman la teoría.
Después de varios experimentos en la obtención de ADN se obtuvo la
misma forma fibrilar del ADN.
Los materiales a usar deben ser medidas exactas siguiendo el procedimiento
indicado, para no tener tendríamos errores experimentales.
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VIII. CONCLUSIONES
Para la extracción de ADN a partir de un hígado de pollo concluimos que
si es posible gracias a la técnica de “extracción de ADN” con los pasos
antes expuestos es muy viable, pero no es aquí donde se demuestra que
fue viable la extracción.
El ADN se encuentra dentro de las células y para poder extraerlo
necesitamos machacar el hígado y hacer una disolución que rompiera los
núcleos de las células. Después sacamos el ADN deshaciéndose de las
proteínas con el zumo y el fairy. Dejamos caer el alcohol que contraerá el
ADN y así poder observarlo.
Dentro de las conclusiones se puede decir que se lograron los objetivos de
la práctica, la separación ya la extracción del DNA a partir de tejido animal
se logro correctamente, ahora esto aun no ha terminado completamente
aun siguen algunos procesos como la purificación del DNA, etc. Para
observar con más claridad las características del DNA, algunas
recomendaciones son el uso adecuado en esta práctica, se necesita de
mucho cuidado y poner atención en los procedimientos ya que cualquier
error podríamos perder todo nuestro trabjo realizado.
En esta practica se logro el objetivo principal y planteado que es la
extracción del ADN en este caso fue de tejido animal, todo esto siguiendo
una serie de pasos para poder lograrlo, así se pudo separar de otros
componentes como proteínas, lípidos, carbohidratos y se pudo distinguir
cual era cual y el resultado final fue la extracción y separación del ADN.
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IX. RECOMENDACIONES
Utilizar distintos detergentes ya que algunos no funcionaran tan bien como
otros. o Mezclar despacio caso contrario corre el peligro de romper el
ADN. o Al momento de agregar el detergente ahitar lentamente.
CUESTIONARIO: 1.- Si pudiésemos tomar una cadena de ADN humano
y la estiráramos de forma lineal nos daríamos cuenta que el ADN humano
tiene una longitud de extremo a extremo.
Como recomendaciones que uno haría seria que se siga investigando mas
sobre otras formas de poder extraer el ADN y poder separarlo, otras formas
en que cualquier tipo de persona aunque con pocos conocimientos sobre
este tema lo pueda hacer por lo menos acompañado de otro que sepa mas,
siguiendo otros pasos y utilizando otras sustancias que fueran un poco
menos peligrosas y mas fáciles de obtener.
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X. BIBLIOGRAFÍA
http://files.biologia-ias-unipaz.webnode.es/200000115-
134081532f/PRACTICA%20DE%20LABORATORIO%20EXTRACCI
ON%20DE%20ADN.pdf
https://www.wakolatinamerica.com/blog-reactivos/post/10-metodos-de-
extraccion-de-adn/
http://victorprietog6.blogspot.com/2018/03/extraccion-del-adn-del-
higado-de-pollo.html
http://ingerayo.blogspot.com/2011/12/reporte-practica-extraccion-
adn.html
https://www.monografias.com/trabajos91/informe-experimento-
extraccion-adn/informe-experimento-extraccion-adn.shtml
