Introducción a la biología celular y molecular 2022

Resolución Taller 7b. Proteínas

Se recuerda que antes de asistir al taller presencial 7b se deben realizar las actividades asincrónicas del
taller 7a que se encuentran disponibles en la plataforma Eva. Estas actividades previas consisten en el
estudio/revisión del material bibliográfico, la visualización de los videos teóricos, una guía práctica de
visualización de estructuras de proteínas y la realización de cuestionarios del tema.

Ejercicio 1. Interacciones intra- e inter-moleculares en proteínas

a) ¿Qué interacciones débiles dan lugar a la formación de hélices alfa y hojas plegadas beta?,
¿entre qué grupos se dan?

Tanto las hélices-alfa como las hojas plegadas beta se encuentran estabilizadas por enlaces de
hidrógeno que se establecen entre el grupo N-H (dador) y el grupo C=O (aceptor) del enlace peptídico.
En hélices-alfa, estas interacciones se establecen entre grupos ubicados a 4 residuos de distancia en la
cadena polipeptídica, mientras que en hojas plegadas beta suelen establecerse entre segmentos
adyacentes de la cadena polipeptídica.

b) Observe la siguiente figura e indique qué tipo de interacciones débiles mantienen a las
estructuras terciarias de la proteína. Marque donde se localizan los enlaces peptídicos.

Los enlaces peptídicos se encuentran representados en el esqueleto de la proteína, del cual salen las
cadenas laterales responsables del establecimiento de la estructura terciaria.

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c) Dos proteínas forman un complejo dimérico en la célula, el cual se mantiene unido

mediante las interacciones débiles establecidas entre los aminoácidos representados en
la siguiente figura:

i) Identifique los residuos aminoácidos involucrados y clasifique las interacciones que tienen
lugar entre los mismos.

En la figura podemos identificar tres interacciones que mantienen unidas a ambas proteínas:
• Interacciones hidrofóbicas entre un residuo de isoleucina y un residuo de leucina
• Enlace iónico (o interacción electrostática) entre los residuos de glutamato y lisina
• 2 Enlaces de hidrógeno entre el grupo hidroxilo de la treonina (actuando como dador) y el
oxígeno de la asparagina (actuando como aceptor), y entre el grupo hidroxilo de la treonina
(actuando como aceptor) y el hidrógeno unido al nitrógeno del grupo amida de la asparagina
(actuando como dador).

ii) Describa qué ocurriría con el complejo si el mismo se encontrará un pH menor a 4.0.

A un pH menor a 4.0, el grupo carboxilo del residuo de glutamato se encontraría protonado como COOH.
Esto resultaría en la pérdida de la interacción electrostática establecida con el residuo de lisina,
pudiendo debilitar la fuerza de unión e incluso resultar en la disociación del complejo.

iii) En el laboratorio se obtuvieron 3 mutantes puntuales de la proteı́na representada en

naranja, donde el residuo de glutamato fue sustituido por los aminoácidos: aspartato,
arginina o serina. Considerando las interacciones descritas en el ejercicio anterior: ¿cuál de
las mutantes provocará la menor alteración de las interacciones entre ambas proteínas?, ¿y
cuál la mayor alteración?

Glu->Asp: El reemplazo de glutamato por aspartato no tiene grandes consecuencias en la interacción

entre las proteínas ya que ambos son residuos ácidos, polares con carga, y el grupo carboxilo del
aspartato, al igual que el glutamato, es capaz de establecer el enlace iónico con el residuo de lisina.

Glu->Arg: El reemplazo de glutamato por arginina sustituye una carga negativa por una positiva en la
cadena lateral. Debido a la proximidad con el residuo de lisina, la presencia de una carga positiva en
lugar del glutamato generaría una repulsión electrostática que podría resultar en la disociación del
complejo

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Glu->Ser: El reemplazo de glutamato por serina resulta en una sustitución de una carga negativa por
una residuo de un aminoácido polar. Si bien esto resulta en la pérdida de la capacidad de establecer una
interacción electrostática, es posible que el aminoácido de serina establezca con el residuo de lisina
interacciones de tipo ion-dipolo o enlace de hidrógeno, por lo que no esperaríamos ver mayores
alteraciones en el complejo.

Por todo lo anterior, la mutación Glu->Asp sería la que provocaría la menor alteración del complejo
mientras que la de Glu->Arg sería la provocaría la mayor alteración estructural.

Ejercicio 2.

En la década de los 60 Christian Anfinsen (Premio Nobel 1972) realizó una serie de
experimentos destinados a contribuir a la comprensión de las fuerzas que determinan la
conformación de una proteína. El conjunto de los resultados obtenidos le llevaron a postular
la “hipótesis termodinámica” para la adquisición de la estructura tridimensional de las
proteínas. Para estos experimentos, Anfinsen utilizó la enzima ribonucleasa.

Observe la estructura de la ribonucleasa e indique:

i) ¿Cuántas cadenas polipeptídicas posee?

La ribonucleasa posee una única cadena polipeptídica

ii) Identifique los tipos de estructura secundaria. ¿Qué
tipo de interacciones forman dichas estructuras?
¿Qué átomos son los que participan en la interacción?

En cuanto a su estructura secundaria, se pueden observar tanto alfa hélices como hojas plegadas beta.
Las interacciones que dan lugar a estas estructuras son enlaces de hidrógeno entre los átomos de la
cadena principal de la proteína. Recomendamos ver la bibliografía del curso


A continuación se presentan esquemáticamente 2 de los experimentos realizados con esta
enzima.

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Experimento 1.
La enzima es tratada con urea 8 M y β-mercaptoetanol (β-ME)(CH2OH--CH2SH). Luego de
este tratamiento la actividad enzimática es menor al 1% de la correspondiente a la
enzima “nativa”. La urea es un agente desnaturalizante que provoca una disminución en el
grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la proteína, ya que (1) compite
por el agua y (2) rompe los enlaces de hidrógeno o las interacciones electrostáticas. El β-
ME es un agente reductor que rompe los puentes disulfuros.

Se remueve la urea mediante diálisis en presencia de β-ME. La actividad enzimática no se
recupera. Se remueve el β-ME y se expone a la proteína al oxígeno del aire. La enzima
recupera casi el 100% de su actividad.

i) ¿Cómo se explica la pérdida de actividad de la enzima por efecto de la urea y del β-ME?

ii) ¿Cómo se podría explicar la recuperación del 100% de la actividad enzimática?

iii) ¿Cómo se podría explicar que la actividad no se recupera hasta tanto no se remueva
el β-ME?

Experimento 2.
La enzima es tratada con urea y β-ME como en el experimento 1. En presencia de urea, se
remueve el β-ME y se expone al aire. Se remueve la urea. La actividad de la enzima es
menor al 1% de la de la enzima nativa.

i) ¿Cuál es la diferencia entre el Exp. 1 y el Exp. 2?

ii) ¿Cómo se explica la diferencia en la actividad de la enzima entre los 2 experimentos?

Discuta las conclusiones generales que puede extraer de este experimento en relación
con la importancia de la secuencia de aminoácidos en la adquisición de la estructura
tridimensional de la ribonucleasa. ¿Esto es así para todas las proteínas?

Respuesta general del ejercicio 1.

Los experimentos de Anfinsen mostraron que cuando un proteína pierde su estructura no puede cumplir
su función (en el caso de la ribonucleasa no el capaz de catalizar la reacción de hidrólisis de ARN). Solo
cuando se recupera la estructura nativa se recupera la función, ya que si la proteína adopta una
estructura alternativa no es capaz de llevar a cabo su función. La estructura nativa de una proteína está
estabilizada por interacciones débiles y a veces (como en este caso), por enlaces disulfuro que se forman
entre dos residuos de cisteína. La secuencia o estructura primaria de la proteína provee la información
necesaria para el plegamiento correcto, aunque en muchos casos no es suficiente para adquirir de forma
espontánea la conformación correcta.

Es importante considerar que la ribonucleasa es una proteína que presenta 4 puentes disulfuro, en los
que están involucrados 8 cisteínas.

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Experimento 1.

i) En este experimento se trata la ribonucleasa con urea y β-ME, lo cual despliega la estructura de la
proteína, al romper las interacciones débiles (con la urea) y puentes disulfuro (con el β-ME). Los
aminoácidos se mantienen unidos entre sí mediante enlaces peptídicos, pero no adoptan la
conformación nativa de la proteína, resultando en la pérdida de la actividad casi total (ver esquema
paso 1).

ii) La remoción de la urea, en primer lugar, permite el establecimiento de las interacciones débiles
correctas. Luego, se retira el β-ME y se forman los enlaces disulfuro correctos debido a que la enzima ya
había establecido las interacciones débiles que estabilizan la estructura nativa y aproximan los residuos
de cisteína para el establecimiento de los puentes disulfuro correctos. De esta forma, la proteína
recupera su conformación nativa y su actividad.

iii) El hecho de que la actividad no se recupere hasta que no se remueva el β-ME se explica considerando
que el establecimiento de los puentes disulfuro correctos es parte de la estructura nativa de la
ribonucleasa y hasta no adoptar la estructura nativa esta enzima no recupera su actividad.

Experimento 2.

i y ii) La diferencia entre ambos experimentos es que en el experimento 2, el β-ME se retira de forma
anterior a la urea. Esto resulta en que se formen enlaces disulfuros entre las cisteínas, pero no
necesariamente entre las cisteínas correctas de la conformación nativa, ya que la presencia de urea
impide que la proteína pueda plegarse correctamente. Cuando se retira la urea, ya hay enlaces
disulfuros incorrectos formados, que impiden que la proteína pueda recuperar su conformación nativa
y por lo tanto no recupera su actividad.

Este experimento demostró que la información para que se establezca la conformación nativa de una
proteína se encuentra en la secuencia de aminoácidos y que esta no se altera con el proceso de
desnaturalización (pérdida de estructura tridimensional) de la proteína.

El plegado de proteínas globulares a partir de sus conformaciones desnaturalizadas es un proceso

notablemente rápido, que se completa en menos de un segundo. Esto puede resultar paradójico, tal y
como puso de manifiesto Cyrus Levinthal en 1968. Una proteína pequeña como la RNAsa A, que tiene
124 aminoácidos tiene 1050 conformaciones posibles. Si la molécula pudiese probar una configuración
cada 10-13 segundos, serían necesarios 1030 años para probarlas todas. Sin embargo, se ha comprobado
in vitro que la RNAsa se pliega en aproximadamente 1 minuto.

Actualmente se trabaja en el concepto de selección acumulativa, según la cual la proteína se va

plegando, formando intermediarios parcialmente correctos que se retienen. Los sitios de iniciación
favorecen la estabilización de estructuras más complejas. En el esquema más abajo se observa un
diagrama de energía libre. El estado de menor energía es el más estable y se corresponde con la
estructura nativa.

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Es importante destacar que la recuperación de la conformación nativa al retirar la urea y el β-ME no

ocurre en todas las proteínas. En la ribonucleasa puede ocurrir porque es una proteína pequeña. Para
asistir el plegamiento de proteínas más complejas, existen otras proteínas llamadas chaperonas, que
ayudan al correcto plegamiento a nivel celular. Algunas de ellas se unen a sitios hidrofóbicos a medida
que se va sintetizando la cadena polipeptídica y de esta forma evitan agregados y plegamientos
incorrectos.