Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias-Departamento de Farmacia
Laboratorio de Microbiología General-Angela Patricia Rojas
Informe 2: Tipos de tinciones.
Hecho por: Nicolás Buitrago Cuesta y Juanita
Pardo
Índice:
1. Objetivos
2. Tinciones
a. Tinción diferencial de gram
b. Tinción de Ziehl-Neelsen
c. Tinción de estructuras
especializadas
3. Conclusiones
4. Referencias
Objetivos:
1. Identificar y caracterizar los diferentes
tipos de tinciones que se usan en el
laboratorio de microbiología
2. Discutir la importancia de las
tinciones en la descripción de la
morfología, carácter gram y
agrupación celular de organismos
bacterianos.
Introducción
Las tinciones son una herramienta esencial
para el primer estudio de identificación y
caracterización de muestras biológicas
bacterianas. Este tipo de técnicas permiten
incrementar el contraste de las bacterias con
respecto al fondo en el que son observadas
bajo la lupa del microscopio, y con ello,
facilitan la determinación de su aspecto,
morfología, tamaño y presencia de estructuras
especializadas, cómo cápsulas y endosporas.
Los investigadores han clasificado este tipo de
técnicas en tinciones simples y diferenciales de
acuerdo con el tipo de reacción entre el
colorante empleado para la coloración y el
cultivo biológico en estudio. Dentro de las
tinciones simples, la más utilizada corresponde
a la tinción de Gram, y dentro de las tinciones
diferenciales, podemos distinguir la tinción
Ziehl-Neelsen, la tinción de endosporas
bacterianas y la tinción negativa o tinción de
cápsulas.
Tinción de Gram
Las tinciones de Gram son muy utilizadas en
la microbiología, porque permiten dar
explicación a algunas características
morfológicas y estructurales de muestras
bacterianas. El principio bajo el cual se rige
esta tinción diferencial permite la
diferenciación de las bacterias por la
naturaleza de su pared celular. Conocer dicha
característica de la bacteria es de suma
importancia no sólo para microbiólogos y
bacteriólogos, sino también para profesionales
de la salud, pues cada bacteria será sensible a
determinados antibióticos, según su carácter
Gram.
Las bacterias Gram positivas se caracterizan
por tener una pared celular gruesa de
aproximadamente 8 capas de peptidoglicano, y
compuesta por ácidos teicoicos y lipoteicoicos,
que le confieren su impermeabilidad. Por su
parte, las bacterias Gram negativas poseen una
pared celular delgada y tienen una membrana
interna y una externa, compuesta por
lipopolisacáridos y lipoproteínas. La
permeabilidad de su membrana externa es
mucho mayor debido a las proteínas porinas
que forman canales transmembranales. [3]
Para este tipo de tinción, el procedimiento es
el siguiente:
1. Colorear con cristal violeta la muestra
previamente sembrada y fijada. El
cristal violeta es un colorante básico
que tiene una fuerte afinidad por la
cromatina y es absorbido gracias al
alto porcentaje de ácido teicoico en su
estructura.
2. Fijar la coloración utilizando el
compuesto lugol (yodo + yoduro de
potasio), que crea el complejo cristal
violeta-yodo
3. Decolorar utilizando una solución de
alcohol-acetona al 70%. Esta mezcla
homogénea deshidrata la capa de
peptidoglicano en las Gram (+), y

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torna la membrana aún más
impermeable, impidiendo así la salida
del complejo cristal violeta yodo. En
las Gram (-), el alcohol disuelve la
membrana externa y crea orificios en
la capa de peptidoglicano que hace
que los cristales colorante-yodo
puedan salir.
Para poder visualizar las gram negativas que
quedaron incoloras se usa cómo colorante de
contraste la fucsina/safranina. Al final de esta
tinción, las bacterias Gram (-) se verán de
color rosado, mientras que las Gram (+)
azul-violetas.[5]
¿Cómo preparar las muestras de manera
óptima para una tinción de Gram?
Es esencial realizar la tinción de Gram sobre
cultivos jóvenes (12 a 18 horas) o células en
fase exponencial de crecimiento, ya que el
envejecimiento celular puede generar
variaciones en el carácter gram de las bacterias
debido a cambios en la composición química
de la pared (especialmente pérdidas de capas
de peptidoglicanos) celular. Por ejemplo, las
Gram (+) en fase de crecimiento más tardío
dan resultados irregulares y/o erróneos
(Servera, 2011). [7][11]
La preparación adecuada de un frotis tiene
cómo objetivo separar los microorganismos en
estudio lo más posible; por ello, es
fundamental para lograr la adhesión de la
muestra bacteriana a la lámina o portaobjetos
que se pone al microscopio. Esta fijación es la
que impide que los microorganismos sean
arrastrados con los lavados de la tinción Gram.
El procedimiento de preparación de frotis se
lleva a cabo en una secuencia de tres pasos:
● Tomar con una asa bacteriológica una
pequeña muestra del cultivo
bacteriano1
● Dejar secar al aire la lámina o
portaobjetos con el cultivo. Es posible
usar la llama del mechero para
acelerar el secado, pero es importante
1
En este paso es importante agregar y esparcir una gota
de agua sobre la lámina antes de incorporar el cultivo
bacteriano.
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que la temperatura del vidrio no
supere los 35-40 grados Celsius.
● Fijar la preparación con calor,
tomando el portaobjetos de manera
invertida y exponiendo la muestra dos
veces durante 1 ó 2 seg a la llama
Cabe aclarar que en este tipo de tinción es
necesario hacer uso del calor para fijar el
colorante, pero para esto es necesario que la
preparación esté completamente seca y que la
pase por el calor por intervalos cortos de
tiempo 3 veces, pues de lo contrario, si la
preparación está fresca o se calienta
directamente sobre la llama por un largo
tiempo las células se van a romper y no será
posible elaborar conclusiones adecuadas sobre
el cultivo.
¿Qué información taxonómica brinda el uso
de la técnica de tinción de Gram?
Si bien la clasificación taxonómica abarca
diversos aspectos cómo el tipo de
metabolismo, las características bioquímicas,
la tolerancia a condiciones ambientales, la
sensibilidad a antibióticos, o la patogenicidad
[10], en este informe será discutida la
relevancia de la técnica de tinción de Gram
principalmente en cuanto a la caracterización
de la forma celular (cocos, bacilos y
espirilos-espiroquetas), de la pared y
membrana celular, del tamaño de las células y
de la morfología y agrupación de las colonias.
Conviene mencionar que el conocimiento de la
membrana celular y la composición
aproximada de la pared celular resulta esencial
para el descubrimiento de ciertas
características asociadas a esta parte de la
célula procariota, cómo por ejemplo su
resistencia a antibióticos y su potencial
patogénico. Tafur., et al (2008), describieron
los siguientes 3 mecanismos a través de los
cuales las bacterias Gram (-) ejercían mayor
resistencia a los antibióticos, que sus
homólogas, las Gram (-):
1. Modificación enzimática de la
estructura del antibiótica
2. Bombas de expulsión que arrojan el
antibiótico desde el espacio
periplásmico hacia el exterior de la
célula

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3. Cambios en la membrana plasmática,
principalmente en la conformación de
las proteínas “canales” denominadas
porinas. [9]
Por su parte también señalaron la capacidad de
algunas Gram (+) de alterar el sitio de acción
de los antibióticos a nivel intracelular, por
ejemplo a través de un cambio en la estructura
terciaria de las proteínas que intervienen en la
formación de la pared celular, y en las
proteínas de unión a ciertos fármacos como la
penicilina. [9]
Del mismo modo, las bacterias Gram (-) gozan
de una característica esencial para la
resistencia ante antibióticos, y es la facilidad
de transmisión intercelular de información
genética mediante plásmidos; las bacterias
Gram (+) no presentan esta particularidad, y
por lo tanto son más sensibles a la acción
directa de los antibióticos.
Imagen 1. Tinción de Gram clásica2
La tinción de gram únicamente incrementa el
contraste, y permite determinar la forma,
tamaño y la disposición relativa de los
microorganismos. Pero dicha tinción no es
suficiente para dar todas las especificaciones
de los microorganismos, pues pueden poseer
más características como lo son las cápsulas y
las endosporas, o pueden ser ácido resistentes
y por lo tanto en la tinción de gram no se
colorearán. Es por esta razón que existen otros
tipos de tinciones como por ejemplo la tinción
negativa, la de endosporas y la Ziehl-Neelsen
[8]
Tinción de Ziehl-Neelsen
La tinción de Ziehl-Neelsen es usada para
distinguir especies de bacterias del género
Mycobacterium y algunas especies del género
2 4
Imagen tomada de Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case,
C. L. (2007). Introducción a la microbiología. Ed.
Médica Panamericana. pp 65
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Nocardia, que tienen la particularidad de ser
muy resistentes a colorantes básicos habituales
cómo el cristal violeta y la safranina-fucsina
3
así cómo a soluciones ácido-alcohólicas. Esta
resistencia que les confiere un alto poder de
patogenicidad, es producto de una pared
celular de muy alta abundancia lipídica. Esta
estructura está compuesta en su mayoría por
ácidos grasos hidrófobos llamados ácidos
micólicos, así cómo por otros constituyentes
normales de la pared celular de otras bacterias,
cómo glicolípidos, fosfolípidos y lípidos
libres, y es responsable de algunas
características de estos géneros de bacterias,
cómo su resistencia a solución
ácido-alcohólicas, su resistencia a detergentes
y su antigenicidad [1]
La estructura de la membrana celular está
conformada por una primera membrana
plasmática constituida por una bicapa de
fosfolípidos, un espacio periplásmico que
separa la membrana de una capa de
peptidoglicanos (lipoarabinomananos) y
arabinogalactanos, y una cubierta de ácidos
micólicos y polisacáridos.
Imagen 2. Pared celular típica de Micobacterias4
La abundancia lipídica de la pared de las
Micobacterias le confiere su carácter
hidrófobo, y con ello las hace resistentes a la
tinción con colorantes básicos a temperatura
ambiente.
3
Las bacterias ácido-alcohol resistentes son también
inertes a la decoloración de la fucsina (la cual penetra a
la célula por acción del fenol en su estructura química).
Imagen tomada de
https://www.medigraphic.com/pdfs/cosmetica/dcm-2018/
dcm182n.pdf

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La metodología de tinción consiste en una
tinción con carbolfucsina a la llama5, que es
tratada con una solución ácido alcohólica y
coloreada nuevamente con azul de metileno.
Las bacterias ácido alcohol resistentes quedan
teñidas de una coloración rosada, mientras que
las bacterias no resistentes a este medio ácido
retienen el azul de metileno en su membrana
celular.
Tinción de estructuras especializadas:
cápsulas, flagelos y endosporas bacterianas
Para identificar con mayor facilidad ciertas
estructuras especiales presentes en algunas
células bacterianas, es usual recurrir a
alternativas diferentes de tinciones simples y
diferenciales cómo la tinción negativa para
cápsulas o la tinción de Dorner.
Tinción negativa para cápsulas
Algunas células procariotas bacterianas
presentan una capa de homopolisacáridos y/o
heteropolisacáridos cómo dextranos y
glucanos.6 Las cápsulas se visualizan mediante
una tinción negativa con nigrosina o tinta
china, en la que el medio circundante se tiñe
de negro y éstas estructuras supramembranales
quedan incoloras y brillantes.
La tinta china está compuesta de pigmentos y
aglutinantes de origen vegetal que la hacen un
colorante aniónico. Al presentar carga
negativa, las cápsulas bacterianas que están
conformadas por heteropolisacáridos cómo el
dextrano que presentan una carga parcial
negativa, repelen el colorante e imposibilitan
su penetración dentro de los organismos. Así
pues, la tinta china colorea el fondo de la
muestra, y las cápsulas quedan incoloras. [6]
5
El calentamiento es esencial para que el colorante
atraviese la pared bacteriana provista de ceras. Al
suspender el calor y lavar con agua fría, los ácidos grasos
se solidifican nuevamente impidiendo la salida del
colorante.
6
Para identificar rápidamente la posible presencia de
cápsulas bacterianas basta con mirar el contenido de
humedad del cultivo bacteriano. Si son muestras muy
húmedas lo más probable es que haya microorganismos
capsulares.
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Tinción de microorganismos esporulados
Las endosporas son células especializadas de
reposo que son producidas por ciertas bacterias
de los géneros Bacillus, Clostridium,
Sporosarcina y Thermoactinomyces, cómo un
mecanismo de diferenciación celular en
respuesta a entornos adversos que limitan la
nutrición de sus células normales
(vegetativas). Las endosporas se forman dentro
de la célula por un proceso llamado
esporulación, no presentan ningún tipo de
actividad metabólica, y son increíblemente
resistentes a condiciones extremas de
temperatura, pH, y concentración de
compuestos químicos.
Están compuestas por un núcleo, una pared
esporular, una corteza o córtex externo a la
membrana, unas cubiertas y un exosporio de
naturaleza proteica y lipídica que no está
presente en todos los tipos de endosporas
bacterianas. La pared de la espora está hecha
de peptidoglucano (PG) (mureína), mientras
que el córtex está hecho por un PG especial
sintetizado por la célula madre original que
presenta las siguientes características [2]:
1. 30% del Ácido N-acetilmurámico
unido normalmente al tetrapéptido,
pero con muy bajo entrecruzamiento.
2. 15% del Ácido N-acetilmurámico sólo
tiene el aminoácido L-alanina en vez
del tetrapéptido habitual
3. 55% del NAM está en forma de éster
cíclico (lactama)
Las cubiertas están formadas por proteínas
ricas en aminoácidos hidrófobos, y en el
aminoácido cisteína.
Las esporas bacterianas de los
microorganismos esporulados no se tiñen con
los colorantes básicos comúnmente utilizados
para otras tinciones diferenciales como la
tinción de Gram. Por tal razón, para lograr la
coloración de estas estructuras se recurre
habitualmente a la técnica Schaeffer-Fulton
que utiliza verde de malaquita, safranina y
fijación con calor.
No obstante, debido a su cualidad de
resistencia, y al lento crecimiento que
caracteriza a éste tipo de microorganismos, la

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apreciación de estas estructuras especializadas
se dificulta y se extiende por un tiempo
prolongado, debido a que las endosporas
deben ser visualizadas en cultivos de más de
48 horas de incubación.
Por lo anterior es importante explorar
alternativas de técnicas de tinción de esporas
bacterianas. Una de ellas es la técnica de
Dorner que emplea fucsina fenicada
(carbolfucsina) junto con nigrosina. En esta
técnica la fucsina fenicada se pone al calor y
logra colorear todas las esporas bacterianas; a
continuación, se agrega nigrosina sobre la
placa o lámina portaobjetos. La nigrosina
extrae el colorante de todas las estructuras del
microorganismo esporulado, menos de las
esporas bacterianas. Al final, las esporas se
verán de una coloración roja-rosada, el resto
de la bacteria incolora, y el fondo negro. [4]
¿Cómo teñir flagelos bacterianos?
Los flagelos son estructuras demasiado finas
para ser visibles al microscopio óptico. Sin
embargo, pueden ser tratadas con suspensiones
coloidales de sales de ácido tánico. Este
precipitado grueso hace que el diámetro de
estas estructuras aumente, de tal forma que al
tratarse con fucsina o nitrato de plata sean
visibles en el microscopio óptico.
Conclusiones:
1. Las tinciones permiten definir las
características generales de los
microorganismos en estudio. La
tinción de Gram brinda información
sobre la morfología de células que
poseen o no peptidoglicano en su
pared celular.
2. La tinción de Zielh-Neelsen nos
permite identificar microorganismos
ácido alcohol resistentes y apreciar su
morfología, mientras que la tinción
negativa permite observar estructuras
capsulares en ciertos organismos.
3. La tinción de esporas puede hacerse
mediante la técnica Schaefer-Faulton o
mediante el método Dorner , y es útil
en bacterias del género Bacillus y
Clostridium
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4. Para una tinción adecuada son
esenciales los procesos de extensión y
fijación del cultivo biológico
mediante el uso de calor o mordientes.
Es de suma importancia realizar los pasos para
poder obtener una tinción adecuada y entender
el microorganismo
Referencias
1. Eliel Mendoza Wong. Biología de las
micobacterias . Disponible en:
http://www.fcq.uach.mx/phocadownlo
ad/DOCENCIA/MATERIAL-DE-EST
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Prácticas Disponible en
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