Modulo2 02 PWP

METODOS DE DETECCION Y UTILIDAD CLINICA DE LOS
AUTOANTICUERPOS EN
ENFERMEDADES AUTOINMUNES
MODULO 2
LABORATORIO DE AUTOINMUNIDAD
EXAMENES INMUNOLOGICOS MARCADORES DE ENFERMEDAD
AUTOINMUNE
• ANTICUERPOS ANTINUCLEARES (ANA)

• ANTICUERPOS ANTI DNA (DNA)
• FACTOR REUMATOIDEO (FR)
• ANTICUERPOS ANTI PEPTIDO CITRULINADO (ANTI CCP)
• ANTICUERPOS ANTI CITOPLASMA DE NEUTROFILOS (ANCA).
• ANTICUERPOS ANTIFOSFOLIPIDICOS: ANTICARDIOLIPINAS Y
ANTICOAGULANTE LUPICO
ENFERMEDADES AUTOINMUNES
REUMATICAS SISTEMICAS (EARS)
LES
VASCULITIS AR
EARS
MII
EMTC
ESCLEROSIS
S SJÖGREN
SISTÉMICA
ENFERMEDADES AUTOINMUNES REUMATICAS SISTEMICAS (EARS)
ENFERMEDADES INFLAMATORIAS
CRÓNICAS
COMPARTEN ETIOPATOGÉNESIS:
• SÍNTOMAS CLÍNICOS COMUNES
• CO-SEGREGACIÓN DENTRO UNA MISMA FAMILIA
• MECANISMO DE DAÑO TISULAR PREDOMINANTE
POR CIC
• PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
ANTICUERPOS ANTI NUCLEO CITOPLASMATICOS
ANA EN SANOS
13,8%
ANA EN INFECCIONES
1 0 - 50%
INDICACIONES CLINICAS PARA LA DETERMINACION DE ANA

ANTECEDENTES HISTORICOS DE LOS
CELULAS LE: POLIMORFONUCLEARES (PMN) QUE
HAN FAGOCITADO MATERIAL NUCLEAR
Hargraves M, Richmond H, Morton R.

Presentation of two bone marrow components,
the tart cell and the LE cell. Mayo Clin Proc.
1948; 27: 25-28
TEST CELULAS LE, Conn, 1994

GOLD ESTÁNDARD PLATAFORMAS ALTERNATIVAS PARA ANA


Sistemas automáticos de reconocimiento de patrones
INMUNOFLUORESCENCIA
 ELISA
INDIRECTA
 Inmunoensayos lineales (LIA)
 Ensayos múltiples por Luminex (ALBIA)
 Inmunoensayos por quimioluminiscencia (CLIA)

COMPARACION
DE IFI CON
NUEVOS
METODOS DE
CRIBAJE
FALSOS NEGATIVOS
SSc y PM/DM
ANA IFI EN HEP2 ES EL MÉTODO GOLD STANDARD
TESTS EN FASE SÓLIDA O MULTIPLEX SOLO DETECTAN LOS AUTOAC. ESPECÍFICOS

CONTRA EL LIMITADO NÚMERO DE AUTOANTÍGENOS QUE POSEEN
TESTS EN FASE SÓLIDA O MULTIPLEX DEBEN TENER SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD

COMPARABLE CON IFI
DEBEN SER CONTRASTADOS FRENTE A STANDARDS INTERNACIONALES
CADA LABORATORIO DEBE ESPECIFICAR EL MÉTODO UTILIZADO PARA ANA

¿COMO EMPEZAR EL ESTUDIO?

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
SUSTRATO HEP -2
SUSTRATO
LINEA CELULAR HEP2
VENTAJAS
 ALTA EXPRESIÓN (CONCENTRACIÓN) DE ANTÍGENOS HUMANOS : ESPECIFICIDAD
 CÉLULAS EN TODOS LOS ESTADÍOS DEL CICLO CELULAR
 CÉLULAS EN MONOCAPA: BUENA VISUALIZACIÓN DE ESTRUCTURAS CELULARES
 RELACIÓN NÚCLEO-CITOPLASMA ALTA
 PRESENCIA DE VARIOS NUCLEOLOS
 CITOPLASMA RICO EN FIBRILLAS Y ORGANELAS
ALTA SENSIBILIDAD
CÉLULAS EN DIVISIÓN: AG. EN DIFERENTES FASES DEL CICLO

QUE SON LAS HEP2000?

El antígeno SSA/Ro
no se detecta
debido a que
cuando se preparan
las Hep2 por
filtración y fijación
se pierde.
Son células genéticamente

modificadas transfectadas para
sobreexpresar antígeno SSA/Ro de
60 kDa. Detecta la presencia con un
patrón único
DIVERSOS PROBLEMAS:
• Título del informe:

• Falta de unanimidad en el habitualmente denominado FAN
criterio para el título de corte. (factor anti núcleo) o ANA (del
inglés, Anti- Nuclear Antibodies).
• Denominación de los
• Falta de consenso en el patrones: se utilizan distintos
contenido del informe nombres para identificar los
mismos patrones
• Dificultad en la estandarización
de la técnica de IFI.
Microscopio Conjugado fluorescente

• Lámpara
• Anti-Ig GAM
• Tipo • Anti-Ig G
• Potencia • Anti-Ig A
• Anti-Ig M
Sustrato • Título
• Tipo
• Cortes de tejido Controles.
• Ratón
• Rata
Expresión de los resultados
• Células de cultivo (HEp-2)
• Comercial
Establecimiento del intervalo de
• Preparativo
referencia
• Variaciones en la fijación
• Fijado Operador Interpretación de los
• No fijado resultados.

• Lámpara
• Anti-Ig GAM
• Anti-Ig M
• Tipo
• Ratón
• Rata
• Comercial
• Preparativo
referencia

• Lámpara
• Anti-Ig GAM
• Anti-Ig M
• Tipo
• Ratón
• Rata
• Comercial
• Preparativo
referencia
ANTICUERPOS ANTI NUCLEO CITOPLASMÁTICOS (FAN/ANA)

Resultado
• Nucleares: positivo
Título: 1/320
Patrón: Homogéneo
• Citoplasmáticos:
positivo
Título:
1/160
Patrón:
fibrilar
• Observaciones:
Método: Inmunofluorescencia indirecta

Sustrato: células Hep2
Dilución de corte: Recomendada: 1/80-1/160
RESULTADO
NEGATIVO : CUANDO NO SE DISCRIMINA UN PATRÓN
FLUORESCENTE DEFINIDO
NEGATIVO
POSITIVO : CUANDO SE PUEDE DISTINGUIR
PERFECTAMENTE UN PATRÓN FLUORESCENTE (POR ENCIMA DE LA
DILUCIÓN DE CORTE)
SEMICUANTIFICAR
POSITIVO
RESULTADO
RESULTADO
NEGATIVO :
• AUSENCIA REAL
• ACS CONTRA AGS MUY SOLUBLES (RO)
• ACS CONTRA AGS CITOPLASMATICOS (JO-1 Y RO).
INCIDENCIA DE ANA POSITIVOS EN HEP2
ENFERMEDAD % DE INCIDENCIA
LES 98 - 100
Esclerodermia > 90
Artritis Reumatoidea 50 - 90
DM/PM 30 – 40
Sindrome Sjögren 40 - 70
Artritis Crónica Juvenil 15 – 30
Lupus inducido por drogas 100
Lupus neonatal 90
Cirrosis biliar primaria 95 – 100

Hepatitis autoinmune 80
PTA 10 – 30
Familiares sanos de pac.con LES 25
Enf. Neoplásica 10 – 30
Dra. Alejandra Ginaca
TIENEN IMPORTANCIA LOS TITULOS DE ANA ?

titulo MAYOR A
1/160: VERDADERO
Título MENOR de
POSITIVO. DEBE
1/40: NEGATIVO
PROSEGUIRSE EL
ESTUDIO.
Títulos igual o mas

de 1/40 y menos de
Las variaciones del
1/160 se
título NO se
consideran
recomiendan para
POSITIVOS DEBILES.
monitorear el curso
en ausencia de
de la terapia en EA
síntomas específicos
se debe monitorear.
HAY ANA FALSOS POSITIVOS y NEGATIVOS?
PACIENTES SANOS:
Familiares de pacientes
• En > 65 años es > 90%
con ANA positivos
• < 65 años es de 72%
FALSOS NEGATIVOS:
Altos títulos Jo-1
PATRONES DE FLUORESCENCIA EN HEP 2
Sitio oficial del Consenso Internacional sobre Patrones de Anticuerpos Antinucleares (ANA) (ICAP)
Sitio oficial del Consenso Internacional sobre Patrones de Anticuerpos Antinucleares (ANA) (ICAP)
NUCLEARES NUCLEOLARES CITOPLASMATICOS APARATO

MITOTICO
a b c
d e f
g

MITOTICO

MITOTICO
Reticular
Granula fino denso
Granular polar Fibrilar


MITOTICO
huso mitótico
NuMA
Centríolo Cuerpo medio

CUAL ES EL SIGNIFICADO DE LOS PATRONES DE ANA?
* CENTROMÉRICO: Relevancia clínica
* Resto de los patrones: confirmarse con un inmunoensayo

para definir especificidad antigenica
UTILIDAD CLINICA
SIRVEN PARA PROPÓSITOS DIAGNÓSTICOS, NO PRONOSTICO Y NO DE
PROGRESIÓN
EL VVP FUE SOLO 11% EN PACIENTES CON BAJA PREVALENCIA DE LA

ENFERMEDAD (2%)
UTILIDAD CLINICA
Los ANA NO caracterizan a una

enfermedad autoinmune en
particular, pero grupos de
EL PATRON DE IFI SOLO TIENE SE HAN DESCRIPTO UNOS 40
autoanticuerpos se encuentran
UN VALOR ORIENTATIVO PATRONES
presentes con mayor frecuencia
en enfermedades autoinmunes
especıficas
AC COMO PRONOSTICO:
• PUEDEN PRECEDER EN MESES, AÑOS O
DECADAS AL DESARROLLO DE UNA
NO SE NEGATIVIZAN NI
ENFERMEDAD AUTOINMUNE. FLUCTUAN SIGUIENDO LA
ACTIVIDAD DE LA
ENFERMEDAD.
ANTI DFS70
APROXIMADAMENTE UN 20 % DE LOS SUEROS POSITIVOS PARA ANA DE INDIVIDUOS SANOS, PRESENTAN

UN PATRON CONOCIDO COMO MOTEADO FINO DENSO (DFS, DENSE FINE SPECKLES).
REPORTADO EN EL 33 % DE LOS PACIENTES ANA POSITIVOS, PERO NO EN SUEROS DE PACIENTES ANA

POSITIVOS CON EAS.
SE HAN ENCONTRADO EN UNA VARIEDAD DE CONDICIONES INFLAMATORIAS: CISTITIS INTERSTICIAL,

DERMATITIS ATOPICA, CANCER Y EN PACIENTES SANOS.
AUTOANTIGENO: PROTEINA DE 70 KDA, PRIMERAMENTE LLAMADA DFS70. AUTOAG PRIMARIO: LEDGF

(FACTOR DE CRECIMIENTO DERIVADO DEL EPITELIO).
POSTULADO COMO UN TEST DE SCREENING PARA DX DE EAS. Marcador biológico útil en la discriminación
de personas con ANA positivos que no evolucionan a enfermedad autoinmune Sistémica.
AC-2 - Nuclear granular fino denso
DFS70/LEDGF
Patrón granular distribuido por

todo el núcleo de las células en
interfase, con heterogeneidad en
tamaño, brillo y distribución de
los gránulos. A lo largo del núcleo
en interfase, hay algunas zonas
MOTEADO PEQUEÑO/FINO OBSERVADO UNIFORMEMENTE más densas y más débiles de los
DISTRIBUIDO SOBRE EL NUCLEO Y LA METAFASE DE gránulos (rasgo muy
CROMATINA, característico). La placa
metafásica muestra un fuerte
patrón granular destacándose
algunas manchas gruesas.
CUANDO LOS ANA SON MENOS UTILES ?
BAJO VALOR PREDICTIVO POSITIVO EN
FAMILIARES DE PACIENTES CON CONECTIVOPATIAS
CIERTAS ENFERMEDADES AUTOINMUNES (AR, PTI, CBP, TAI)
PACIENTES CON IMPLANTES MAMARIOS DE SILICONA
FIBROMIALGIA
INFECCIONES CRONICAS
NEOPLASIAS
PERSONAS MAYORES
EMBARAZADAS
PERSONAS SANAS
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

• LA EDAD Y EL GÉNERO DEL PACIENTE.
• EL USO DE DROGAS QUE PROVOQUEN LES INDUCIDO, COMO POR EJEMPLO: HIDRALAZINA.
• EL TÍTULO OBTENIDO.
• EL PATRÓN INMUNOFLUORESCENTE. ESTOS PATRONES PUEDEN CAMBIAR CUANDO SE LEEN A DIFERENTES

DILUCIONES. DEBE SER INFORMADA LA PRESENCIA DE MÁS DE UN PATRÓN CON SUS RESPECTIVOS TÍTULOS.
• TENER EN CUENTA LOS CRITERIOS DIAGNÓSTICOS DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES SISTÉMICAS.
• LA POSIBILIDAD DE LA PRESENCIA DE AUTOANTICUERPOS COMO FENÓMENOS PARANEOPLÁSICOS, COMO PUEDE

OCURRIR EN EL CÁNCER DE MAMA.
• LA POSIBILIDAD DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS, COMO, POR EJEMPLO, SUELE OCURRIR EN LA

LEPRA O PACIENTES HIV POSITIVOS.
• LA POSIBILIDAD DE TENER RESULTADOS POSITIVOS EN PACIENTES SANOS Y EN PERSONAS CON EDAD AVANZADA.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
ANA TIENEN ALTA SENSIBILIDAD DIAGNÓSTICA PARA EARS
REALIZAR TEST DE ANA EN INDIVIDUOS CON SOSPECHA CLÍNICA

DE ENFERMEDAD REUMÁTICA
TITULO DE ANA: CONSIDERAR TÍTULO ALTO A PARTIR DE 1/ 640
TÍTULO DE ANA NO CORRELACIONA CON GRADO DE ACTIVIDAD

DE LA ENFERMEDAD. NO ÚTIL PARA MONITOREAR EL CURSO DE LA
TERAPEÚTICA
PATRON DE FLUORESCENCIA: INDICATIVOS DE ESPECIFICIDAD DE

ANTICUERPO
ANTICUERPOS ANTI DNA NATIVO
DESCRIPTOS EN LA DECADA DEL 50 EN PACIENTES CON LES
ANTI DNA dc SON MARCADORES ESPECIFICOS DE LES, ANTI DNA sc

REPRESENTAN UNION INESPECIFICA.
SU AUSENCIA NO EXCLUYE LES
CRITERIO DE Dx DE LA ACR EN LES
ROL PATOGENICO EN LA NEFRITIS LUPICA.
ASOCIADO CON ACTIVIDAD DE LA ENFERMEDAD EN NEFRITIS LUPICA.

LES ACTIVO: AUMENTO DE AC ANTI DNAdc Y DISMINUCION DE C3 Y C4.
METODOS DE DETECCION
METODO DE FARR (RIA)
CRIBADO:
ELISA ELISA
CONFIRMACION
CLIFT (CRITHIDIA :
LUCILIAE) IFI O FAR ASSAY
OTROS
COMPORTAMIENTO DE LAS TECNICAS SEGÚN LA AVIDEZ DE UNION AG-AC

ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD
IFI EN HEP2 IFI EN CRITHIDIA LUCILIAE
UTILIDAD
Diagnóstico
PATRON NUCLEAR HOMOGENEO CON Pronóstico
REACCION POSITIVA DE LOS
CROMOSOMAS EN METAFASE. Monitoreo de
tratamiento
Involucrados en
patogenia
IFI EN CRITHIDIA LUCILIAE (CLIFT)
NEGATIVA
IFI EN CRITHIDIA LUCILIAE (CLIFT)
POSITIVA
Anti-ADN de alta avidez es muy específico para
anti-DNA (ADN dc)
Anti-ADN de baja avidez también ocurre en

enfermedades autoinmunes distintas del SLE.
Anti-ADN puede estar presente años antes del

debut clínico de LES.
Medición frecuente de anti-ADN puede ayudar

a predecir futuras exacerbaciones.
Anti-ADN de alta avidez se correlaciona con la

nefritis del LES.
Anti-ADN está involucrado directamente en la

inducción de la nefritis.
Antinucleosoma y anti-histona son parte de los

mismos anticuerpos
ANTIGENO NUCLEARES EXTRAIBLES (ENA)
SON ANTICUERPOS DIRIGIDOS

• PROTEÍNAS ASOCIADAS AL ADN: ANTI-
CONTRA PROTEÍNAS CENP-B, ANTI-LÁMINAS NUCLEARES,
NUCLEARES NO HISTONAS QUE ANTI-Scl-70
PUEDEN EXTRAERSE DEL
NÚCLEO CON SOLUCIONES • PROTEÍNAS ASOCIADAS AL ARN: ANTI-
SALINAS DE BAJA FUERZA Sm, ANTI-U1-Rnp, ANTI-Ro/SS-A, ANTI-
IÓNICA DIRIGIDOS CONTRA:
La/SS-B Y ANTI-Jo1
METODOS DE DETECCION
ENZIMOINMUNOANÁLISIS
CLIA
LIA
IMMUNOBLOTTING
ANTICUERPOS ANTI NUCLEO CITOPLASMATICOS & ENA
DE LOS ANA A LOS ENA: LOS TITULOS Y PATRONES DE ANA DAN INFORMACION
DEL PROCEDER EN LA EVALUACION DE LOS ENA
SÓLO SE JUSTIFICA SU DETERMINACIÓN CUANDO LOS SÍNTOMAS
ORIENTEN A UNA CONECTIVOPATÍA ESPECÍFICA
SÓLO SE JUSTIFICA SU DETERMINACIÓN CUANDO LOS SÍNTOMAS
ORIENTEN A UNA CONECTIVOPATÍA ESPECÍFICA
GENERALMENTE, SE SOLICITAN AC ANTI-ENA CUANDO EL ESTUDIO

DE ANA POR IFI ES POSITIVO.
LOS TITULOS Y PATRONES DE ANA DAN INFORMACION DE LA

NECESIDAD DE CONTINUAR EN LA EVALUACION DE LOS ENA
SITUACIONES EN LAS QUE LOS ANA RESULTAN NEGATIVOS EN

PACIENTES CON ELEVADA SOSPECHA DE EARS: SSA/RO, RIB-P O JO-1.

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METODOS DE DETECCION Y UTILIDAD CLINICA DE LOS

• ANTICUERPOS ANTINUCLEARES (ANA)

INDICACIONES CLINICAS PARA LA DETERMINACION DE ANA

Hargraves M, Richmond H, Morton R.

TEST CELULAS LE, Conn, 1994

GOLD ESTÁNDARD PLATAFORMAS ALTERNATIVAS PARA ANA

 Ensayos múltiples por Luminex (ALBIA)

 Inmunoensayos por quimioluminiscencia (CLIA)

ANA IFI EN HEP2 ES EL MÉTODO GOLD STANDARD

TESTS EN FASE SÓLIDA O MULTIPLEX SOLO DETECTAN LOS AUTOAC. ESPECÍFICOS

TESTS EN FASE SÓLIDA O MULTIPLEX DEBEN TENER SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD

DEBEN SER CONTRASTADOS FRENTE A STANDARDS INTERNACIONALES

CADA LABORATORIO DEBE ESPECIFICAR EL MÉTODO UTILIZADO PARA ANA

¿COMO EMPEZAR EL ESTUDIO?

CÉLULAS EN DIVISIÓN: AG. EN DIFERENTES FASES DEL CICLO

QUE SON LAS HEP2000?

Son células genéticamente

• Título del informe:

Microscopio Conjugado fluorescente

Microscopio Conjugado fluorescente

Microscopio Conjugado fluorescente

ANTICUERPOS ANTI NUCLEO CITOPLASMÁTICOS (FAN/ANA)

Método: Inmunofluorescencia indirecta

Cirrosis biliar primaria 95 – 100

Familiares sanos de pac.con LES 25

TIENEN IMPORTANCIA LOS TITULOS DE ANA ?

Títulos igual o mas

PATRONES DE FLUORESCENCIA EN HEP 2

NUCLEARES NUCLEOLARES CITOPLASMATICOS APARATO

NUCLEARES NUCLEOLARES CITOPLASMATICOS APARATO

NUCLEARES NUCLEOLARES CITOPLASMATICOS APARATO

Granula fino denso

Granular polar Fibrilar

NUCLEARES NUCLEOLARES CITOPLASMATICOS APARATO

Centríolo Cuerpo medio

CUAL ES EL SIGNIFICADO DE LOS PATRONES DE ANA?

* CENTROMÉRICO: Relevancia clínica

* Resto de los patrones: confirmarse con un inmunoensayo

EL VVP FUE SOLO 11% EN PACIENTES CON BAJA PREVALENCIA DE LA

Los ANA NO caracterizan a una

APROXIMADAMENTE UN 20 % DE LOS SUEROS POSITIVOS PARA ANA DE INDIVIDUOS SANOS, PRESENTAN

REPORTADO EN EL 33 % DE LOS PACIENTES ANA POSITIVOS, PERO NO EN SUEROS DE PACIENTES ANA

SE HAN ENCONTRADO EN UNA VARIEDAD DE CONDICIONES INFLAMATORIAS: CISTITIS INTERSTICIAL,

AUTOANTIGENO: PROTEINA DE 70 KDA, PRIMERAMENTE LLAMADA DFS70. AUTOAG PRIMARIO: LEDGF

AC-2 - Nuclear granular fino denso

Patrón granular distribuido por

CUANDO LOS ANA SON MENOS UTILES ?

BAJO VALOR PREDICTIVO POSITIVO EN

FAMILIARES DE PACIENTES CON CONECTIVOPATIAS

CIERTAS ENFERMEDADES AUTOINMUNES (AR, PTI, CBP, TAI)

PACIENTES CON IMPLANTES MAMARIOS DE SILICONA

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

• EL PATRÓN INMUNOFLUORESCENTE. ESTOS PATRONES PUEDEN CAMBIAR CUANDO SE LEEN A DIFERENTES

• TENER EN CUENTA LOS CRITERIOS DIAGNÓSTICOS DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES SISTÉMICAS.

• LA POSIBILIDAD DE LA PRESENCIA DE AUTOANTICUERPOS COMO FENÓMENOS PARANEOPLÁSICOS, COMO PUEDE

• LA POSIBILIDAD DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS, COMO, POR EJEMPLO, SUELE OCURRIR EN LA

ANA TIENEN ALTA SENSIBILIDAD DIAGNÓSTICA PARA EARS

REALIZAR TEST DE ANA EN INDIVIDUOS CON SOSPECHA CLÍNICA

TITULO DE ANA: CONSIDERAR TÍTULO ALTO A PARTIR DE 1/ 640

TÍTULO DE ANA NO CORRELACIONA CON GRADO DE ACTIVIDAD

PATRON DE FLUORESCENCIA: INDICATIVOS DE ESPECIFICIDAD DE

DESCRIPTOS EN LA DECADA DEL 50 EN PACIENTES CON LES

ANTI DNA dc SON MARCADORES ESPECIFICOS DE LES, ANTI DNA sc