HERRAMIENTAS DE

BIOLOGIA
MOLECULAR
EN
MEDICINA

REACCIÓN EN
CADENA DE LA
POLIMERASA
(PCR)
Reacción en cadena de la polimerasa│ PCR

- La técnica de PCR se desarrolló en 1986 por Kary Mullis.

- Permite la amplificación de un segmento específico de ADN de
interés en millones de veces.
-Se basa en la capacidad que posee las ADN polimerasas en
replicar el ADN.
- Se utilizan ADN polimerasas de microorganismos termoestables
- Para la reacción son necesarios: dNTPs, cebadores (primers),
buffer óptimo y cofactores (Mg2+), Polimerasa termoestable, ADN
molde y un termociclador.
Reacción en cadena de la polimerasa│ PCR

Pasos de la PCR (ciclos de amplificación)

- Desnaturalización del ADN (98 grados)

- Unión del cebador (annealing) (48-72 grados)

- Enlongación de la cadena (72 grados)

- Se repiten los ciclos 32 veces

Reacción en cadena de la polimerasa│ PCR
Reacción en cadena de la polimerasa│ PCR

Gel de agarosa para verificar

Electroforesis de ácidos nucleicos

Soporte: agarosa o
poliacrilamida

Detección: colorantes
fluorescentes
PCR en tiempo real (qPCR – PCR cuantitativa)

Permite amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la

amplificación.
Se utilizan fluorocromos que se intercalan a la doble hebra de ADN u otros. La
fluorescencia es detectada a través de un termociclador apto para PCR en tiempo real.

PCR convencional: detección después de que se completan los ciclos

PCR en tiempo real: detección durante la amplificación
PCR en tiempo real (qPCR – PCR cuantitativa)

Permite amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la

amplificación.
Se utilizan fluorocromos que se intercalan a la doble hebra de ADN u otros. La
fluorescencia es detectada a través de un termociclador apto para PCR en tiempo real.
 PCR en tiempo real (qPCR – PCR cuantitativa)

Primer en 5´ Sonda Taqman

Primer en 3´

No fluoresce Fluoresce
PCR│ Convencional vs “real time”

Muestra 1
Muestra 2
Estandar
26 = 64 copies
PCR en tiempo real (qPCR – PCR cuantitativa)

Transcripción reversa • Para cuantificar el producto de

expresión de un gen: mRNA
• Para cuantificar un genoma de RNA:
SARS-Cov2

PCR en tiempo real

Fluorescencia fuerte Fluorescencia muy débil

Hibridización Aumenta la fluorescencia según el número

de ciclos

Extensión Repetir

Desnaturalización
 HERRAMIENTAS DE
BIOLOGIA
MOLECULAR
EN
MEDICINA

Inmunoensayos

Cátedra de Bioquímica y Biología Molecular

Fac. Ciencias Médicas, UNLP
 Inmunoensayos

Métodos de detección inmunológicos

La unión específica de un anticuerpo con su

antígeno es la base de varias técnicas que
identifican / cuantifican un antígeno o
anticuerpo determinado en una muestra
compleja.
Inmunoensayos

ELISA

Test rápidos (cintas de flujo

lateral)

Western blot

Inmunofluorescencia
 Sistema Inmune Humoral (repaso / generalidades)

• Antígenos: Son sustancias que estimulan la produccion de Ab

• Macromoléculas
• Reconocidos como “foráneos” por el sist. Inmune
• Proteínas de cubierta de virus y bacterias
• Carbohidratos de superficie de células o virus

• Anticuerpos: Son proteínas producidas por las células B que unen Ag con gran especificidad
• La unión marca al Ag para su destrucción o interfiere con su función
• Un Ab dado se unirá a una region pequeña (epitope) del Ag
• Un Ag puede tener varios epitopes
Inmunoensayos │ ELISA*

La prueba de ELISA se basa en la reacción antígeno-anticuerpo.

La técnica permite la detección / cuantificación de Antígenos o
Anticuerpos utilizando anticuerpos unidos a una enzima capaz de generar
un producto detectable (Ej: coloreado)

Soporte
(inmunoadsorbente)

*enzyme-linked immunosorbent assay

“ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas”
 Inmunoensayos │ ELISA
Para detectar Anticuerpo circulante (Anti-COVID, HIV, HCV)

Para detectar Antígeno (Proteínas virales circulantes,

hormonas, marcadores tumorales)
 Inmunoensayos │ ELISA

Aplicaciones clínicas

- Diagnóstico de infecciones por microorganismos, al detectar la presencia de

antígenos del agente infeccioso
- Confirmación de la presencia de anticuerpos, pueden ser anticuerpos contra
cualquier microorganismo, inclusive vacunas, autoanticuerpos, etc.
- Cuantificación de metabolitos, hormonas, medicamentos, etc.

Ejemplos:

- En mujeres embarazadas Medición de HGC-cualitativa y cuantitativa

Toxoplasmosis (Inmunoglubulinas)
Rubeola (Inmunoglubulinas)
HIV
CMV
- Diagnóstico de SARS-Cov2, HIV
- Monitoreo de hormonas-tratamiento
Evolución de la respuesta a la infección por SARS-Cov2 en pacientes con COVID-19
Inmunoensayos │ Cinta de flujo lateral COVID-19
Inmunoensayos │ Cinta lateral
Inmunoensayos │ Inmunoblot*

La técnica se utiliza para detectar proteínas específicas en una muestra que

posee una mezcla compleja de proteínas.

*”Western Blot”
Inmunoensayos │ Inmunoblot*

Ej: Para detectar Anticuerpos Anti-HIV

1. Separación de las proteínas de

un lisado de HIV por electroforesis

2. Transferencia de las proteínas a

una membrana

3. Corte de la membrana en tiras

4. Incubación de las tiras con suero

de pacientes y anticuerpos anti-IgG
humana conjugados con una enzima
(y sustrato cromógeno)

*”Western Blot”
Inmunoensayos │ Ventajas y desventajas

Ej: Detección de No determina la presencia de virus circulante

Anticuerpos
Período ventana

No distingue entre infección aguda, crónica o resuelta

Falsos (-) hemodializados o inmunosuprimidos o período ventana

Falsos (+) en pacientes con algunas enfermedades o infecciones

No para niños <18m de madres (+)

Alta sensibilidad y bajo costo (especialmente combinada

con la detección de Ag)

No requiere mucho equipamiento ni las

instalaciones/precauciones de un laboratorio de biología
molecular
Inmunoensayos │ Inmunofluorescencia

La técnica se basa en la detección de moléculas mediante la utilización de

anticuerpos específicos que poseen unidos químicamente a una sustancia
fluorescente. Nos permite visualizar el antígeno en células o secciones de tejido.
Inmunoensayos │ Inmunofluorescencia

Ejemplos de su utilización en la clínica

Detección de Trypanosoma cruzi Detección del virus de la Influenza A

http://www.vircell.com/soporte-tecnico/galeria-de-imagenes/IFA/
HERRAMIENTAS DE
BIOLOGIA
MOLECULAR
EN
MEDICINA III:

PROTEÍNAS
RECOMBINANTES
 Producción de proteínas recombinantes

Las proteínas recombinantes son aquellas que se producen expresando un gen de un

organismo en otro organismo distinto.

Deben ser biológicamente activas.

Es importante decidir para cada proteína recombinante cual es el organismo de expresión más
adecuado.

Producción en bacterias

Producción en levaduras

Producción en células de insectos

Producción en células de mamíferos

Producción de proteínas recombinantes │ Insulina

- Menor respuesta inmunológica, con el tiempo los pacientes que utilizaban insulina porcina
desarrollaban diferentes respuestas inmunológicas que imposibilitaban el uso de la misma.
- Son física y químicamente equivalentes a la insulina producida por el páncreas humano.
- Su producción es en escala industrial (biorreactores), reducción de los costos
Generación del vector recombinante (ADNr)

*
El fragmento de interés
puede ser un producto
de PCR
Producción de proteínas recombinantes│ Vectores
Corte del ADN │ Endonucleasas de Restricción (ER)

Tipo II: estas enzimas pueden realizar dos tipos de cortes.

Extremos cohesivos: hacen una muesca en punto de terminado de una hebra

y en otro punto diferente en la hebra complementaria, dejando de 2 a 4 nt
desapareados en cada extremo, por lo tanto las porciones de simple hebra
que quedan son complementarias entre si y por lo tanto tienden a unirse.

Extremos romos: la muesca se realiza en el mismo lugar en ambas hebras en

los enlaces fosfodiéster opuestos y por lo tanto no quedan hebras simple
remanentes.
Reacción de Unión │ ADN ligasa
*
El ADN extraído se digiere con alguna ER
quedando fragmentado.

Un determinado fragmento de ADN aislado

deberá unirse con un vector de clonación
digerido con la misma ER.

El apareamiento de extremos cohesivos

complementarios facilita el proceso de
ligación.

Los fragmentos de diferente origen (vector y

el fragmento de interés) se unen por la ADN
ligasa, que da lugar a una molécula de DNAr.
Producción de proteínas recombinantes │ Ej
Se están desarrollando diversos tipos de posibles vacunas contra la
COVID-19, entre ellas:

- Vacunas basadas en proteínas recombinantes: utilizan fragmentos

inocuos de proteínas o estructuras proteínicas que imitan el virus
causante de la COVID-19, con el fin de generar una respuesta
inmunitaria.

- Vacunas con virus inactivados o atenuados: utilizan un virus previamente

inactivado o atenuado, de modo que no provoca la enfermedad, pero aún
así genera una respuesta inmunitaria.

- Vacunas con vectores víricos: utilizan un virus genéticamente modificado

que no causa la enfermedad, pero da lugar a proteínas coronavíricas que
inducen una respuesta inmunitaria.

- Vacunas con ARN y ADN: un enfoque pionero que utiliza ARN o ADN
genéticamente modificados para generar una proteína que por sí sola
desencadena una respuesta inmunitaria.

Organización Mundial de la Salud (https://www.who.int/es)

BIBLIOGRAFIA

• Stryer 7ma Ed
• Meisenberg 4ta Ed
• Resumen de qPCR
• Lehninger 7ma Ed