Inmunologa III

Inmunoensayos. Clasificacin

Definicin
Mtodo analtico basado en la reaccin antgeno- anticuerpo
Hay muchos formatos , buscando diferentes caractersticas de funcionamiento.

Qu es un inmunoensayo?
Puede ser cualitativo (identificacin), semicuantitativo o cuantitativo. Encuentran aplicacin en muchos campos, no slo en el rea clnica: ambiental, alimentaria, agronmica, etc.

Antgenos

Sustancias que pueden ser reconocida por reaccin con ella de anticuerpos. Estructuras qumicas muy diferentes: protenas, lpidos, polisacridos, cidos nucleicos, etc. Cada antgeno suele presentar varios determinantes antignicos o epitopos.

Antgenos
Nativos. Se obtienen directamente a partir del patgeno. Ej. una protena purificada Recombinantes Pptidos sintticos

Anticuerpos policlonales
La inmunizacin de animales inyectando antgeno por la va adecuada, en dosis adecuadas y en el adyuvante adecuado, (inmungeno)

produccin de anticuerpos con diferentes afinidades y con especificidad por diferentes determinantes antignicos (anticuerpos policlonales).

Anticuerpos policlonales

Conejo, cabra, oveja, etc.

Purificacin de anticuerpos
Separar el suero

Anticuerpos monoclonales
Se obtienen inmortalizando plasmocitos por fusin con clulas de mieloma de ratn. Las clulas fusionadas (hibridomas) producirn inmunoglobulinas idnticas a las que produca el plasmocito. Por dilucin lmite se puede aislar(clonar) cada hibridoma, mantenerlo y expandirlo en cultivo.

Anticuerpos monoclonales

Plasmocitos murinos

Fusin

hibridomas

Anticuerpos monoclonales

Cultivo de clulas individuales en pequeo volumen Produccin de Ac Crecimiento continuo

+ +

+
-

Anticuerpos monoclonales

Cultivo en grandes volmenes

Recuperar y purificar el AcMo secretado

Anticuerpos monoclonales
Ventajas con respecto a los policlonales: Alta especificidad, reconocen un nico epitopo Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con las mismas caractersticas. Desventajas: Mayor costo

Ejemplos

Cualitativo o de identificacin: Cuantitativo: ELISA

inmunoblot

Inmunoblot Ejemplo: Supongamos que queremos saber si estn presentes en un suero los anticuerpos que reconocen la banda de PM = 30 kDal del antgeno de Toxoplasma gondii.

kDa

94
43 30 14.4

SDS-PAGE

Direccin de la electroforesis

log PM

Rf

Transferencia

nitrocelulosa

Incubacin con el suero problema

Conjugado enzimtico

Sustrato

Ejemplos:
Etapas principales: separacin por electroforesis segn pesos moleculares (SDS-PAGE), transferencia a membrana de nitrocelulosa , incubacin con suero problema, incubacin del conjugado (por ejemplo enzimtico), revelado y examen contra patrn de pesos moleculares.

Clasificacin de inmunoensayos
Catica en general, variados criterios de clasificacin a) diseo competitivo o no competitivo b) homogneos y heterogneos c) por el mtodo de deteccin d) con o sin marcado e) por el tipo de marca

Segn el diseo del ensayo

De reactivo limitado o competitivos (inmunoensayos propiamente dichos)

De reactivo en exceso o no competitivos (ensayos inmunomtricos)

 Competitivos: Inmunoensayos en que se utiliza el marcado de antgeno o anticuerpo. Una cantidad limitada de anticuerpos que es insuficiente para unir todo el antgeno. El antgeno marcado compite con el antgeno sin marcar por los anticuerpos. La cantidad de analito se determina a partir de la regresin correspondiente.

Competitivo- Captura de anticuerpos

E
Ac marcado

E E
Sustrato

+
Ag muestra

Seal

Ag muestra + Ac marcado

Seal

[Ag]

Competitivo- Captura de antgeno

Seal

Antgeno marcado [Ag] Seal

Muestra

Lavado

Mtodos no competitivos o inmunomtricos

El antgeno a cuantificar se une a un exceso de anticuerpos. Por ejemplo, con el anticuerpo fijado a la fase slida, revelando con anticuerpo marcado. La concentracin de antgeno se determina a partir de la cantidad de anticuerpo marcado que se une.

No competitivo- sandwich de anticuerpos

Exceso de antgeno eliminado por lavado

bloqueante
Ag

+ E

E Sustrato

Seal

Seal

Curva standard

[Ag]

Ensayos con marca enzimtica

Las ms utilizadas son: peroxidasa (horseradish peroxidase, HRP), PM 44 kdal fosfatasa alcalina(AP), PM 80-84,5 kDal Ventajas disponibles comercialmente se pueden conjugar por tcnicas simples tienen varios sustratos.

Ensayos con marca enzimtica

Generacin de la seal La ltima parte de un inmunoensayo en que la marca es enzimtica es la cuantificacin de la enzima. Mtodos de deteccin: a) Espectrofotomtrico o colorimtrico. Se mide la aparicin de un cromforo. b)Fluoromtrico- Se mide la aparicin de un producto fluorescente c)Quimioluminiscente- Se mide la aparicin de un producto luminiscente.

Ensayos con marca enzimtica: lmites de deteccin (zeptomoles, 10-21 moles)

AP:
quimioluminiscencia fluorescencia color 1 100 50000

HRP:
25000 -2000000

Segn el diseo del ensayo

homogneos

heterogneos

 heterogneos: Los ms utilizados. Diversos formatos : microplacas, partculas magnticas, membranas de nitrocelulosa, cortes de tejidos, o en ensayos homogneos, sin pasos de separacin

Mtodos homogneos y heterogneos

Heterogneos: implican un paso de separacin del antgeno unido del no unido. Por ejemplo ELISA, los pasos de lavado son etapas de separacin. Homogneos: no se requiere la separacin del antgeno unido del no unido.

Heterogneos

Heterogneos Ventajas y desventajas: Ms difciles de automatizar Mayor tiempo de anlisis Menos interferencias, ms especficos y sensibles Instrumentacin menos costosa Admiten mayor tamao de muestra, as disminuye el lmite de deteccin. Ms verstiles en cuanto a tipo de analito

Heterogneos
Algunos mtodos de separacin:
Precipitacin fraccionada con sulfato de amonio, etanol en fro o PEG. Unin de la forma unida a una fase slida (EIA, partculas magnticas) Centrifugacin

Homogneos:
Ventajas y desventajas: Ms precisos Al ser en general automatizados se llevan a cabo sin entrenamiento especial Son ms costosos en reactivos En general slo sirven para frmacos

Homogneos
La cuantificacin de la reaccin Ag-Ac en los EIA homogneos se realiza por cambios(modulacin) en la seal proveniente de la marca sin hacer separacin fsica de las formas libre y unida. El cambio de seal depende de la inhibicin , activacin o cambios conformacionales en la enzima. monitoreo teraputico de frmacos(digoxina) deteccin de drogas de abuso.

Homogneos:
Podramos distinguir entre otros : a) de modulacin directa . Las seales de la marca unida al Ag se ve modificada cuando se produce la unin del Ac. Por ejemplo, un cambio conformacional de la enzima o impedimento estrico. b) de modulacin indirecta. Un antgeno es acoplado a un modulador o grupo prosttico cuya actividad es modificada por la unin del antgeno al anticuerpo.

Homogneos

Ag Enzima

Ag

Sustrato
Ag

Homogneos:

S Ag

Enzima activa

Enzima inactiva

Homogneos:
Deteccin y cuantificacin:
Las medidas se pueden hacer con un simple espectrofotmetro o con un analizador automtico de qumica clnica.

 Introduccin a los inmunoensayos de fluorescencia:

Fluorescencia:
3 etapas( excitacin, decaimiento, emisin) ocurre en ciertas molculas (hidrocarburos poliaromticos o heterociclos), llamados fluorforos o colorantes fluorescentes. Si el fluorforo es modificado para localizar una regin o un componente especfico de una muestra: Sonda o conjugado fluorescente
Fluorescena.

Fluorescencia
Diagrama de Jablonski
S1 2

S1
1 hexc.. 3 hem. S0

S0

Fluorforos
O

HO

O C OH R2

Fluorescena
R1

 Las sondas fluorescentes permiten detectar componentes particulares de ensamblados complejos, incluyendo clulas vivas, con mucha sensibilidad y especificidad. Poderosas tcnica para identificacin de componentes

Fluorescencia
Fuente de energa: lmpara incandescente (Hg) o un
lser.

Fluorescencia
No todas las molculas que han sido excitadas vuelven al nivel de base por emisin de fluorescencia. Hay otros procesos que compiten Rendimiento cuntico: Relacin entre el nmero de fotones fluorescentes emitidos y el nmero de fotones absorbidos por el fluorforo. (etapa 3/etapa 1) Desplazamiento de Stokes

Instrumentacin
2 tipos de instrumentos son los ms utilizados en el laboratorio de inmunologa clnica: a.microscopio de fluorescencia - Muestra la fluorescencia sobre estructuras que son reconocidas por sondas (sobre corte de tejidos, cultivo de microorganismos). Identificacin b. citmetro de flujo - Mide la fluorescencia de clulas individualizadas en una corriente que fluye. Identificacin y cuantificacin

Inmunofluorescencia indirecta

Antgeno tisular

Inmunofluorescencia indirecta

suero de paciente(IgG)

Inmunofluorescencia indirecta

+ anti-IgG humana (de

conejo por ejemplo) con marca fluorescente

Inmunofluorescencia indirecta

Microscopio de luz UV

Inmunoensayos de fluorescencia resuelta en el tiempo

El desplazamiento de Stokes en la fluorescencia es normalmente de 30- 50 nm. Sin embargo, para ciertos compuestos, quelatos de dicetonas con Eu por ejemplo, ese desplazamiento puede ser de 250- 300 nm. El tiempo de decaimiento para la mayora de los compuestos fluorescentes es de nanosegundos. Sin embargo, para estos compuestos de Eu, es mucho mayor, de micro a milisegundos. Ambas caractersticas permiten discriminar la fluorescencia delruidoutilizando equipamiento adecuado.

Inmunoensayos de fluorescencia resuelta en el tiempo

Despl. Stokes Fluorforos

ns sms

30-50nm 250- 300 nm

Quelatos de Eu con dicetonas

Inmunoensayos de fluorescencia resuelta en el tiempo

Fluorescencia

componentes fluorescentes de la muestra

quelatos

decaimiento

deteccin t(s)

400

800

1000

Quimioluminiscencia
Es el fenmeno que ocurre en las lucirnagas: una reaccin qumica con un muy alto rendimiento energtico produce una molcula potencialmente fluorescente. (No hay excitacin luminosa como en la fluorescencia) Usualmente son reacciones redox catalizadas por enzimas que involucran O2 o H2O2 y un sustrato orgnico oxidable. La energa se libera como luz visible.

Quimioluminiscencia

Oxidante (H2O2,, perborato Na) PO

N2

Luz, 425 nm

Luminol

Intermediario electrnicamente excitado aminoftalato

Quimioluminiscencia
Se utiliza para detectar concentraciones muy bajas de molculas, menor lmite de deteccin que en los mtodos isotpicos y en otros enzimticos.

Tcnica analtica quimioluminiscente

Para inmunoensayos se marcan Ag o Ac con sustancias que participan en la reaccin quimioluminiscente (luminol, peroxidasa), y la quimioluminiscencia es el paso final en la deteccin. Se hacen en fase slida, o en tcnicas homogneas

Quimioluminiscencia
La medida de la luz emitida por la reaccin quimioluminiscente se realiza en un luminmetro. Componentes luminmetro: Compartimiento de muestra aislado de la luz Fotomultiplicador de alta sensibilidad Tambin puede haber un sistema para hacer llegar la muestra a la cmara. La emisin de luz medida se relaciona con la concentracin de analito refirindola a soluciones con concentraciones conocidas.

Tcnica analtica quimioluminiscente

Las medidas deben hacerse en unos pocos segundos ya que la luz se emite a menudo como una rfaga corta inmediatamente despus de la mezcla de los reactivos.

Electroquimioluminiscencia

Electroquimioluminiscencia
Marca: Ru(bipy)2+3 3+ 2+ Ru Ru
En presencia de N(Pr)3, en un nodo, el pasaje de la forma +3 a +2 va acompaado de quimioluminiscencia., Con partculas magnticas y un imn asociado al electrodo, se realiza la reaccin all.

Electroquimioluminiscencia
Ejemplo: TSH anti-TSH-biotina(1); anti-TSH-Ru(bipy)3,(2), muestra con TSH(3) Incubacin a 37

Partcula magn

2 Streptavidina

Electroquimioluminiscencia
Ejemplo: TSH anti-TSH-biotina(1); anti-TSH-Ru(bipy)3,(2), muestra con TSH(3) Incubacin a 37
ELECTRODO

IMN

.Anal Chim Acta, 378, 1(1999)

 Para poder utilizar la reaccin Ag- Ac en un inmunoensayo, siempre debe buscarse una forma de hacer evidente esa reaccin (revelado). Hay diferentes metodologas de deteccin.

Coloides metlicos

Complejos de Ru
Ltex
Enzima

Marcado
Fluorforo Hemates Radioistopo Partculas de colorante

Aglutinacin de partculas

Aglutinacin de partculas

 Se enfrenta una cantidad fija del reactivo ltex a diluciones en serie del analito. Se observa a simple vista hasta qu dilucin hay aglutinacin. Semicuantitativo El lmite de deteccin del reactivo ltex se ajusta previamente por titulacin con standards. Puede haber diferencias entre diferentes operadores.

Ventajas: Bajo costo Requiere escaso equipamiento No requiere gran destreza del operador

Desventajas: Semicuantitativo a menos que se modfique cambiando el sistema de reaccin de portaobjetos a cubeta (turbidimetra, nefelometra).

Exceso Ac Exceso de Ag

Equivalencia

Concentracin de Ag (g)

 Inmunoprecipitacin cuantitativa

Muy laborioso el anlisis qumico de los precipitados

+

Se sustituy el anlisis por la determinacin de la turbidez de mezclas de Ag y antisuero Primer paso hacia nefelometra y turbidimetra automatizadas

Inmunoensayos de aglutinacin. Deteccin por dispersin de luz

mU Abs

conc.

mU Abs

Marcado con partculas

Sin marcado

conc.

Inmunoensayos por dispersin de luz

Fuente luminosa Muestra

Turbidmetro

Nefelmetro

Detector

Inmunoensayos por dispersin de luz

Seguimiento de la reaccin: Turbidimetra- Mide la luz dispersada mediante la disminucin en la intensidad del rayo incidente al pasar por la muestra. Se puede realizar en un espectrofotmetro.

Inmunoensayos por dispersin de luz

Nefelometra-Mide la dispersin de luz como un incremento promedio de la luz que es dispersada a un ngulo cuando el rayo incidente pasa a travs de la muestra. La mejor sensibilidad se logra cuando la fuente de luz es lser.

Dispersin de luz segn el tamao de partcula

Rayleigh-Debye Rayleigh .

Mie

Inmunoensayos por dispersin de luz

Segn la teora de la dispersin de la luz (Rayleigh) , cuando una luz monocromtica, de longitud de onda , intensidad I0 incide sobre una pequea partcula(dimensiones 0.05 ), se establecen sobre ella dipolos oscilantes que sirven como fuentes secundarias de emisin.

Inmunoensayos por dispersin de luz

El patrn de dispersin se modifica con el tamao de partcula, al pasar de monmeros a agregados.

Medida cintica vs. medida a punto final

Abs A

t(s)