LOS METODOS INMUNOLOGICOS EN BIOLOGIA

CELULAR

02
LOS METODOS INMUNOLOGICOS EN BIOLOGIA
CELULAR

03
 Estructura de un anticuerpo

VL Vh Variable
Fab
Liviana CL Ch1

Pesada Área de
bisagra Ch2 Constante
Fc
Ch3

(Taim Talks Med, 2019) 04

 Estructura de un anticuerpo

VL Vh SITIOS DE UNIÓN A ANTIGENO

CL Ch1 DETERMINA ALOTIPO

Ch2 SITIO DE UNIÓN AL

COMPLEMENTO

Ch3 SITIO DE UNIÓN A CELULAS

(Taim Talks Med, 2019) 05

 Temas a abordar hoy
INMUNOFLUORESCENCIA
- ELABORACIÓN DE
ANTICUERPOS
-

INMUNOPRECIPITACIÓN
- TIPOS DE ANTICUERPOS
-

CROMATOGRAFÍA DE
AFINIDAD
INMUNODETECCIÓN
-
-

ELISA
- CITOMETRÍA DE FLUJO
-
06
1.Inmunofluorescencia

07
PRINCIPIO DE LA
INMUNOFLUORESCENCIA:

Empleo de compuestos
fluorescentes que se conjugan a la
región Fc de los anticuerpos sin
afectar su especificidad que a su
vez reconocen la molécula de
interés.

Las moléculas fluorescentes

absorben luz de una longitud de
onda (excitación) y emiten luz de
otra longitud (emisión).

08
PRINCIPIO DE LA
INMUNOFLUORESCENCIA:
Directa e indirecta.

09
PRINCIPIO DE LA
INMUNOFLUORESCENCIA:
Fluorocromos.

Colorantes usados para marcar los anticuerpos.

Se detectan por la emisión de luz de color

cuando se excitan con la longitud de onda
adecuada.

Fluorocromos más usados:

Fluoresceína Rodamina

DAPI GFP

10
MÉTODOS DE
INMUNOFLUORESCENCIA:
Selección de anticuerpos.
DIRECT INDIRECT

11
MÉTODOS DE
INMUNOFLUORESCENCIA:
Selección de fluorocromos.

Para seleccionar los fluorocromos

debe considerarse:
Las características
espectrales.
Mínimo solapamiento entre los
espectros de emisión cuando
se realiza multiplexación.
Las características del
microscopio de fluorescencia a
emplear.

12
MÉTODOS DE

. Keratin 8/18 (C51) Mouse mAb #4546

INMUNOFLUORESCENCIA:
Fijación.

Un fijador debe preservar las

células en un estado "realista",
inhibiendo la autolisis, idealmente.

Fijadores más usados:

Formaldehído (al 4%)

AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb

Formalina
Glutaraldehído
Metanol #5318

El fijador varía según el

anticuerpo. Cell signaling technology (2017) 13
MÉTODOS DE
INMUNOFLUORESCENCIA:
Fijación.

El tiempo de incubación del fijador

también determina la calidad de
la fijación.

(H) Fijación óptima a los 15

minutos.
Cell signaling technology (2017)

14
 MÉTODOS DE
INMUNOFLUORESCENCIA:
Permeabilización.

La permeabilización debe realizarse para el

reconocimiento de epítopos intracelulares.

Detergentes: Formación de poros para el

acceso de anticuerpos.
Ej. Tritón X-100, NP-40, TWEEEN, Saponina.

Alcoholes: Fijación y desnaturalización

intermedia. Usados para mejorar la señal de
ciertos organelos y del citoesqueleto.
Ej. Metanol, Etanol.
Cell signaling technology (2017)

15
MÉTODOS DE
INMUNOFLUORESCENCIA:
Bloqueo.

Reducción de ruido de fondo causado por

uniones distintas a las previstas.
Reactivos de bloqueo se unen
generalmente a proteínas hidrofóbicas o
cargadas.

Bloqueadores más usados:

Serum normal 5% en PBS + 0,3% Tritón
X-100.
Image-IT® FX Signal Enhancer #11932

Cell signaling technology (2017)

16
MÉTODOS DE
INMUNOFLUORESCENCIA: Cell signaling technology (2017)

Inmunotinción.

Anticuerpos primarios:
Cada anticuerpo tiene
una concentración
recomendada de
acuerdo al tiempo de
incubación.

Lavado e incubación secundaria:

3 lavados por 5 min en PBS - Remoción de anticuerpos no unidos o unidos con baja
afinidad a regiones no deseadas.

Incubación secundaria aplicada por 1-2 horas, protegida de la luz.

17
MÉTODOS DE
Cell signaling technology (2017)
INMUNOFLUORESCENCIA:
Montaje.

Aplicación de luz de alta energía

conlleva el foto-blanqueo de los
fluorocromos durante la captura de
la imagen.

Aplicación de reactivos de montaje

como ProLong® Gold Antifade
Reagent #9071 mejora la resolución.

Sellado con esmalte.

18
APLICACIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA:
THE HUMAN PROTEIN ATLAS.

19
APLICACIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA:
THE HUMAN PROTEIN ATLAS.

https://www.proteinatlas.org/
20
2.Inmunoprecipitación

21
 PRECIPITACIÓN CONCENTRAR Y AISLAR
DE UN ANTÍGENO UNA PROTEÍNA (ANTÍGENO)
PARTICULAR

EVENTUAL ACOPLAMIENTO
A UN SUSTRATO

4 PRINCIPALES TIPOS DE
INMUNOPRECIPITACIÓN Y 2
TIPOS DE CAPTURA

Rashid, K. A., et all, 2002 22

 Tipos de
inmunoprecipitación
DE PROTEÍNAS
INDIVIDUALES
Anticuerpo específico para
una proteína conocida. DE COMPLEJOS PROTEICOS
Antígeno junto a cualquier proteína o ligando
vinculado a él.
Posible cubrimiento del epítopo por parte del
complejo
Las proteínas pueden no existir nunca en un solo
complejo en un momento dado.

antígeno-prot MHC Rashid, K. A., et all, 2002 23

 Tipos de inmunoprecipitación

DE CROMATINA
Ubicación del sitio de unión del ADN en el genoma para una proteína de
interés (histonas y factores de transcripción).
Enfoque in vivo
Precipitación del complejo proteínas ADN mediante unión de anticuerpo
específico.
Reticulación.
Identificación mediante PCR

DE ARN
Similar a cromatina pero se
seleccionan ribonucleoproteínas.

Rashid, K. A., et all, 2002 24


CAPTURA DIRECTA
Inmovilización del anticuerpo en
microperlas supramagnéticas o de
agarosa.
Captura de perlas a través de
anticuerpo (inmunoprecipitación).
Rashid, K. A., et all, 2002
Tipos de captura
CAPTURA INDIRECTA
Anticuerpos específicos a la
proteína se añaden directamente a
la mezcla.
Flotan y se unen a sus objetivos.
Se agrega proteína A/G.
Anticuerpos se pegan a las perlas
25
3.Cromatografía de
afinidad

26
 PRINCIPIO DE LA CROMATOGRAFÍA DE
INMUNO-AFINIDAD

-Método de purificación de antígenos o

anticuerpos de una solución heterogénea como
un serum
-Los anticuerpos están unidos a una fase solida
que forme una matriz
(Abbas et al. 2022)

-Una buena cromatografía tiene:

(Abbas et al. 2022) Alta eficiencia
Buena estabilidad mecánica
Poros pequeños tienen más área superficial pero no son Baja afinidad no especifica
accesibles para muchas proteínas, los grandes son accesibles Grupos para unión de anticuerpos
pero la inmovilización es menor, 30-50 nm es lo más común Tamaño optimo de los poros
(Martinez, 2023)
(Martinez, 2023) 27

MATRICES Y
COLUMNAS
-Las más comunes para la
columna son agarosa,
celulosa
-Polímeros como
poliacrilamida y
polimetacrilato son buenos y
baratos
-Si se necesita que se haga a
altas presiones la columna
debe ser de silica o azlactona
Materiales y
reactivos
UNION DE
BUFFERS
ANTICUERPOS
-Buffer de aplicación:
-Unión directa vía extremos
aporta las condiciones en la
amino o carboxilo (no se
que los anticuerpos
controla la orientación)
óptimamente se unen a su
-Fragmentos Fab (exponen
antígeno 7 pH
un sulfhidrilo -SH)
-Buffer de elución: debilita
-Carbohidratos residuos
la afinidad mediante
(se oxidan a aldehído y
cambios de pH o agentes
forman iminas)
caotrópicos
28
(Martinez, 2023)
 Inmuno-afinidad vs Tag histidina
DESVENTAJAS VENTAJAS
-Concentraciones altas -Simple y barata
de imidazol puede -El tag histidina no
remover iones metálicos interfiere con la
VENTAJAS DESVENTAJAS de proteínas estructura de la proteína
-Las resinas de -Algunas proteínas no -la afinidad de el tag con
-altamente anticuerpos son de deseadas pueden unirse la matriz no depende de
especifica al tag (de naturaleza la proteina
reusabilidad
bacteriana)
-La elusión por pH limitada
es altamente -hacer anticuerpos
efectiva específicos puede
ser costoso

(Piccard, 2020)
29
 Purificación de
MARK / MARG LO-MG
anticuerpos
Proteína origen ventajas desventajas

-Puede llegar a altas purezas de IgG -No se puede unir a la IgG3 de humanos
pared de
Proteína A -Versátil para IgG de mamíferos
Staphylococcus o ratas que representa una fracción de
(fc) -Fácilmente escalable para
aureus importancia de anticuerpos
producciones comerciales

-No se puede unir a muchas Ig humanas

Proteína G superficie celular -Reconoce IgG3 y de ratas
(fc) de estreptococos -Reconoce IgG de varios vertebrados -Puede retener muchos contaminantes
de un suero bovino

-Puede reconocer células T y -En mamíferos el 60% de las cadenas

Proteína L Peptostreptococ fragmentos Fab livianas son kappa y el restante es
(L-kappa) cus magnus -Puede reconocer todas las clases de lambda
Ig (G,M,D,E,A) -Retiene contaminantes de un sueros 30
(Piccard, 2020)
 Sulfolink column
(Thermo Fisher)

Se seleccionaron 4 se sintetizaron al 85% Se buscaron titers con Se purificaron de forma seriada

péptidos del ORF1p de pureza con una ELISA (presencia de con cromatografía de
como inmunógenos cisteína adicional el anticuerpos) y se inmunoafinidad, mediante los
para generar el N-terminal determinaron 2 péptidos de menor afinidad, la
anticuerpos vinculado a KLH para péptidos con los titers sustancia que fluyo se sometió
aumentar la respuesta más altos a la columna con los péptidos
inmunitaria, y se de altos titers, para luego ser
introdujeron en eludida
conejos 31
4.Elisa

32
 ELISA

Enzyme-linked
immunosorbent assay o
ensayo de inmunoabsorbente
ligado a enzimas.
Requiere:
Cuantificación de marcador
-Antígeno a detectar
de interés.
-Anticuerpo ligado a enzima (específico)
Enzimas en lugar de
-Sistema para estimar la cantidad de
compuestos radioactivos.
antígeno

(SHLESINGER, 2019) 33
ELISA LA SUPERFICIE DE LA PLACA DE
CULTIVA DIRECTAMENTE
DIRECTO con la muestra y se incuba con un
anticuerpo conjugado a una enzima.
Lavado de anticuerpos no unidos del medio.
Agregar sustrato que genera señal
proporcional a la cantidad de antígeno en
la muestra.
Antígenos de alto peso molecular.
ELISA más simple.
Requiere mucho tiempo y es costoso.

(SHLESINGER, 2019) 34
 UNIÓN DE DOS PASOS; ANTICUERPO
PRIMARIO Y SECUNDARIO
ELISA Incubación de anticuerpo primario en una placa
INDIRECTO recubierta de antígeno.
Se agrega anticuerpo secundario marcado que
reconoce el anticuerpo primario.
Se agrega sustrato para amplificar la señal.
Diagnóstico de infecciones y cuantificación de
anticuerpos.
Se puede unir más de 1 anticuerpo marcado por
objetivo.
Altamente sensible y más flexible.
Posible reactividad cruzada o señal no específica

(SHLESINGER, 2019) 35
 DOS ANTICUERPOS ESPECÍFICOS
ambos anticuerpos lo capturan en la placa de
ELISA detección.
SANDWICH Antígeno se añade a anticuerpo primario unido
a placa.
Se añade anticuerpo secundario al complejo.
Anticuerpo secundario conjugado a enzima o
marcador.
Agregación de sustato cromogénico
Señal de color directamente proporcional a
cantidad de antígeno.
Altamente específico, se puede usar para
proteínas de peso molecular alto y bajo.
(SHLESINGER, 2019) 36
 DETERMINACIÓN POR CAPACIDAD DE
COMPETENCIA
ELISA Antígeno de interés compite con antígeno de
referencia marcado.
COMPETITIVO Grupo de anticuerpos no marcados se fija a
una placa junto con antígeno marcado.
Se añade muestra no marcada en diferentes
cantidades.
Se mide el desplazamiento del antígeno
marcado.
La intensidad de la señal es inversamente
proporcional a la intensidad de la señal.

(SHLESINGER, 2019) 37
ESTUDIO DE ENAS
(Natividad López Riquelme et al., 2009)

AUTOANTICUERPOS
ANTÍGENOS (ANA)
EXTRAÍBLES DEL
NÚCLEO Dependiendo de la
enfermedad se pueden
o ENAs son importantes encontrar diferentes
para el diagnóstico de autoanticuerpos, van dirigidos
algunas enfermedades a una gran cantidad de
autoinmunes. estructuras intranucleares.
ELISA
El método ELISA es efectivo
para detectar ANAs anti-
ENA, lo que permite
diagnosticar y correlacionar
con síntomas clínicos a
pacientes con enfermedades
autoinmunes 38
5-6.Elaboración de
anticuerpos

39
 Tipos de anticuerpos

Cadena Liviana
Cadena Lambda
Cadena Kappa

Liviana
Cadena Pesada
Pesada Cadena Gamma (IgG)
Cadena My (IgM)
Isotipos
Cadena Alpha (IgA)
Cadena Delta (IgD)
Cadena Epsilon (IgE)

(Taim Talks Med, 2019) 40

(Taim Talks Med, 2019)
Características de los
isotipos
Diferencias estructurales y de pesos
moleculares

Diferencias Funcionales

Diferencias de localización y
concentración

(Thermo Fisher, 2010) 41

 Diferencias entre
anticuerpos

Diferencias isotípicas:
diferencias en su región constante IgG IgA

Diferencias ideotípicas:
diferencias en su región variable
IgG IgG

Diferencias alotípicas:
diferencias en alelos del mismo gen
constante IgG IgG

(Taim Talks Med, 2019) 42

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES:

1. inocular con inmunógeno 2.colecta de serum 3.añadir anticoagulante

6. Anticuerpos policlonales

4. centrifugar para colectar 5. Calentar a 65°C para

el sobrenadante eliminar proteínas
contaminantes

(Yu et al., 2015) 43

 INOCULAR

INMUNOGENO Epitopos
Sustancia que induce a una respuesta inmune:
Reactivos
Proteínas, pequeñas moleculas organicas
cruzados

APTENOS
No inducen una respuesta por si mismos,
necesitan un "Carrier" como: BSA

ADYUVANTES
Sustancias refuerzan la producción de una
respuesta inmune hacia el antigeno
(Delves et al., 2017) 44
INOCULAR

Es un proceso largo de varias semanas en la que

se deben administrar refuerzos que van
incrementando en concentración para alcanzar
titers más altos de anticuerpos

Al obtener el serum tendremos una mezcla de

varios tipos de anticuerpos en la que se espera que
los titers más altos sean los de interés, con una
purificación obtendremos aún una mezcla de varios
tipos de antígenos por eso son policlonales

(Delves et al., 2017) 45

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

Remoción del vaso

Aislamiento de linfocitos B Productores de un epítopo especifico

Fusión con una célula

"inmortal"
Linfocito tumoral incapaz de secretar
Fusión en polietilenglicol

Los hibridomas se
La concentración promedio de cada
distribuyen en placas
microtituladoras pocillo es de menos de 1 célula en
HAT

Solo producirá un tipo de anticuerpo

El Hibridoma Tendrá un tiempo de vida largo

Tendrá una gran capacidad de

proliferación asimismo de secreción
(Delves et al., 2017) 46
ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS

El proceso de producción es por lejos mucho más eficiente en ratones que en humanos
Sin embargo nuestro sistema inmune reacciona en muchos casos contra estos
anticuerpos y les impide cumplir su función.

Gracias a la ingeniería genética (recombinación de ADN)

se han podido combinar los anticuerpos de dos formas
distintas.
Fusionar las regiones variables de los anticuerpos de
ratón con regiones constantes de anticuerpos
humanos (a)
Insertar las regiones complementarias determinantes
en anticuerpos humanos (b)

(Delves et al., 2017) 47

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POR
BACTERIOFAGOS
Formación de
una librería

Combinaciones en Alta expansión

Ampliación
tándem de cadenas al llevar al
livianas y pesadas con bacteriófago
retro
la proteina de al hospedero
transcripción
cobertura del virus

Selección por panning en

una fase solida (Delves et al., 2017) 48
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POR
BACTERIOFAGOS

Anticuerpos Ventajas Desventajas

Coste y tiempo de producción bajo

Reconocimiento de múltiples epítopos
Variable entre lotes
Alta sensibilidad (proteínas en bajas
Policlonales concentraciones)
Alta probabilidad de reactividad cruzada
No tienen tanta especificidad
Fácil de acoplar con fluoroforos
Unión rápida al antígeno

Alta reproducibilidad Alto coste de producción

Posibilidad de producción en grandes cantidades Requiere más tiempo de producción y la producción del
Monoclonales de un mismo anticuerpo hibridoma
Mejor para ensayos de cuantificación Pequeños cambios al epítopo en la proteína puede hacer
que la deje de reconocer del todo

(Labclinics, 2018) 49
7.Imunodetección

50
 IMMUNOBLOTTING
IDENTIFICACIÓN DE
O WESTERN BLOTTING
ANTÍGENOS
Reconocidos por anticuerpos
monoclonales o policlonales.
Solubilización de proteínas con SDS.
Separación mediante SDS-PAGE.
Transferencia electroforética a membrana.
Tinción reversible (rojo Punzó).
Acceso de agentes de imunodetección.
Bloqueo de sitios de unión no específicos.
Se agrega anticuerpo primario y se lava.
Se marca complejo anticuerpo-antígeno.
Detección de actividad enzimática.
(Liu et al., 2021) 51
 COVID-19
REESTRUCTURACIÓN DE LA PRUEBA

ABARATAR COSTOS DE PRUEBAS

Seleccionando proteínas spike y nucleocaspid
(proteínas estructurales esenciales del SARS-CoV-2)

PROTEÍNAS CON ALTA

INMUNOGENICIDAD
Capacidad que tiene un antígeno de activar el
sistema inmunitario.
Complejo antígeno-anticuerpo monoclonal permite la
identificación de COVID-19.

(Liu et al., 2021) 52

8.Citometría de flujo

53
PRINCIPIO DE LA CITOMETRIA DE
FLUJO:

Análisis de células que pasan a

través de láseres mientras están
suspendidas en una solución
buffer.

Se mide la dispersión y emisión

resultante de la energía lumínica
en varias longitudes de onda.

Uso de moléculas fluorescentes y

anticuerpos para detección de
proteínas específicas.
54
CUÁNDO EMPLEAR LA CITOMETRIA DE
FLUJO:

EXPERIMENTOS DONDE SE
NECESITA INFORMACIÓN
CUANTITATIVA.

Número de células de cierto tipo.

Cantidad de una proteína

específica en cierto tipo celular.

Actividad funcional de una

proteína

55
APLICACIONES CITOMETRIA DE
FLUJO:

56
GRACIAS
 BIBLIOGRAFÍA

‌ inston, S. E., Fuller, S. A., Gallagher, S. R., & Hurrel, J. G. R. (2011). Immunoblotting and
W
immunodetection. Current Protocols in Cell Biology, 52(1).
https://doi.org/10.1002/0471143030.cb0602s52

Liu, D., Wu, F., Yu Wan Cen, Ye, L., Shi, X.-Y., Huang, Y., Fang, S., & Ma, L. (2021). Comparative
research on nucleocapsid and spike glycoprotein as the rapid immunodetection targets of
COVID-19 and establishment of immunoassay strips. 131, 6–12.
https://doi.org/10.1016/j.molimm.2021.01.005
Natividad López Riquelme, Roza, B., Garrido, F., Obdulia Noguera Moya, Antonia Espasa
Sempere, & Bello, D. C. (2009). Análisis comparativo de tres métodos de ELISA frente a
Inmunodot para la determinación de antígenos extraíbles del núcleo (ENAs).
https://doi.org/10.1016/s0213-9626(09)70022-8

00
 BIBLIOGRAFÍA
Cell signaling technology (2017). A guide to succesful immunology.
Rashid, K. A., Hevi, S., Chen, Y., Le Cahérec, F., & Chuck, S. L. (2002). A Proteomic Approach
Identifies Proteins in Hepatocytes That Bind Nascent Apolipoprotein B. The Journal of Biological
Chemistry, 277 (24). pp. 22010-22017. doi:10.1074/jbc.M112448200.

Keene JD, Komisarow JM, Friedersdorf MB (2006). «RIP-Chip: the isolation and identification of
mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts».
Nat Protoc 1 (1): 302-7. PMID 17406249. S2CID 25925403. doi:10.1038/nprot.2006.47.

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functionally diverse landscape of RNA transcripts». Genome Res. 19 (3): 381-94. PMC 2661799.
PMID 19116412. doi:10.1101/gr.082503.108.

SHLESINGER, R. (2019, April 17). ELISA: ¿Qué es? ¿En qué consiste? ¿Cuáles son los distintos
tipos de este ensayo y en qué se diferencian? AllScience; AllScience. https://www.e-
allscience.com/blogs/articulos/elisa-que-es-en-que-consiste-cuales-son-los-distintos-tipos-de-
este-ensayo-y-en-que-se-
diferencian#:~:text=En%20ciencias%20biol%C3%B3gicas%2C%20espec%C3
00