INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA DRA.

GLADYS PATIÑO SOTO

HOSPITAL NACIONAL HIPOLITO
ANTICUERPOS CELULARES UNANUE
ANTICUERPOS DE ENFERMEDADES
AUTOINMUNES
 AUTOINMUNIDAD

Las enfermedades autoinmunes son más frecuentes en mujeres

En la respuesta inmune: COMPONENTE HUMORAL
(ANTICUERPOS) y CELULAR.
Las CÉLULAS T REGULADORAS son imprescindibles para
controlar los fenómenos autoinmunes.
La síntesis de AUTOANTICUERPOS representa la activación
policlonal de células B
Existe una RESPUESTA INMUNITARIA EXAGERADA contra
sustancias y tejidos que normalmente están presentes en el
cuerpo
FISIOPATOLOGÍA DE ENFERMEDADES
AUTOINMUNES

FACTORES ECOLOGIA ESTADO MANIFESTACION

HEREDITAROS AUTOINMUNE PRE-CLINICO DE ENFERMEDAD
ANTICUERPOS
 AUTOANTICUERPOS NATURALES
Los AC naturales que están en el suero de
individuos sanos
En ausencia de inmunización deliberada de
cualquier antígeno
Reaccionan con uno o mas AUTO-ANTIGENOS
Esta demostrado que los autoanticuerpos
REACTIVOS DE CÉLULAS B Y T están presentes
en individuos sano y virtualmente en todos los
vertebrados.
 IMPORTANCIA AUTOANTICUERPOS EN LA CLINICA
1. DIAGNÓSTICO de enfermedad Autoinmunes.
2. Definir un SUBGRUPO ESPECIAL en una
enfermedad o síndrome.
4. Definir PRONÓSTICO.
5. Acceder a la ACTIVIDAD de la enfermedad.

FUENTE: La Rosa Fabian CB. Revista Cubana de Reumatología 20 (1) 2018

 HISTORIA
1948 1950 1950 1957 1975 1970-1980
• Células LE – • INMUNOMARCAJE • Inmunofluorescencia • Anti-DNA • IFI HEp2 • ENA
Hargraves • Coons & kaplan • Fue el primer auto • Cultivo de
anticuerpo descrito células humanas
en pacientes con LES

Fuente: Anti-DNA antibodies—quintessential biomarkers of SLE David S. Pisetsky Nature Reviews Rheumatology 2015
ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
• DNA
• Histonas
• Nucléolos
• Proteínas nucleares no histonas/
Antígenos Nucleares Extractables
(ENA)
 ESTRUCTURA DE LA CELULA
NÚCLEO
•Nucleolo
•Cromatina
•Nucleoplasma
oProteínas no histonas
asociadas a ADN
oProteínas no histonas
asociadas a ARN

CITOPLASMA
•Organelas
•Filamentos
ANA EN LA PRACTICA CLINICA APS

SS CREST INFECCIONES

PROCESO
ANA SS

+
INFLAMTORIOS

EMTC ANCIANOS

LES
AUTOANTICUERPO ≠ENFERMEDAD
ANA + EN SUJETOS SANOS
oLos individuos sanos pueden tener ANA+ a títulos bajos

o31.7% de los individuos sanos tiene ANA+ 1:40

oMenos 5% de los individuos sanos tiene ANA+ > 1:320

oLas mujeres y los ancianos tienen mayor prevalencia de

ANA+ sin significado clínico.
MÉTODOS DE DETECCIÓN
METODOS INESPECIFICOS
Inmunofluorescencia Indirecta IFI

METODOS ESPECIFICOS
Radioinmunoanalisis (RIA)
Western Blot o Inmunoblot
Ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA)
Quimioinmunoluminiscencia (CLIA)
 RECOLECCION DE MUESTRA
Todos los derivados de sangre humana deben considerarse potencialmente infecciosos.
En este ensayo utilice solamente suero recién extraído y correctamente refrigerado obtenido
mediante procedimientos de venipunción asépticos aprobados
No se deben agregar anticoagulantes o conservantes.
Evite utilizar suero hemolizado, lipémico o contaminado con bacterias.
Almacene la muestra a temperatura ambiente durante un lapso no superior a las 8 horas.
El suero puede almacenarse a entre 2 - 8° C, durante un lapso no superior a las 48 horas.
Si prevé retrasos para realizar la prueba, almacene el suero de prueba a –20° C o menos.
Evite múltiples ciclos de congelado/descongelado que pueden ocasionar la pérdida de
actividad de los anticuerpos y proporcionar resultados erróneos.

FUENTE: documento M29 del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI): Protección de los trabajadores de laboratorio de enfermedades infecciosas ("Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease").
METODOLOGÍA DE DETECCIÓN
 FUNDAMENTOS DE LA IFI
La INMUNOFLUORESCENCIA es una técnica utilizada para visualizar
la distribución de una PROTEÍNA O ANTÍGENO ESPECÍFICO en células
o secciones de tejido utilizando la especificidad de los anticuerpos
por su antígeno para DIRIGIR MARCADORES FLUORESCENTES a las
biomoléculas dianas de forma específica.
Se divide en DOS ETAPAS:
1. El anticuerpo primario no marcado, se une con el antígeno diana.
2. El anticuerpo secundario, lleva el fluoróforo, identifica al anticuerpo
primario y se une a él.

Nota: varios anticuerpos se pueden unir al anticuerpo primario y la señal

aumentaría.
 IFI: DETERMINAR ANA
Actualmente la inmunofluorescencia es usada para:

Serotipificación e identificación de virus.

Detección y cuantificación de niveles de anticuerpos en tejidos o

células.

Identificación de agentes infecciosos.

 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

• Sobre una lámina que lleva pegado un antígeno conocido, añadimos el suero
del paciente.
• Si el suero contiene anticuerpos específicos, éstos se unen al antígeno.
• Posteriormente se añaden ANTICUERPOS ANTI-INMUNOGLOBULINA
HUMANA marcada con isotiocianato de fluoresceína (conjugado)
• El conjugado se unirá a los anticuerpos del paciente.
 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

• La lectura se hace con un microscopio de fluorescencia, cuya luz estimula al

ISOTIOCIANATO DE FLUORESCEÍNA, haciendo que emita luz fluorescente de color verde.
• La observación de luz verde fluorescente en la lámina indica la presencia del antígeno en
la muestra (IFD) o de anticuerpos específicos en el suero (IFI)
 SUSTRATOS CELULARES
Un sustrato ideal de células HEp2 debe cumplir ciertos estándares:

Los NÚCLEOS CELULARES deberían ser grandes y de tamaño y forma regulares.

La DISTRIBUCIÓN DE CÉLULAS ni demasiado densa, ni demasiado dispersa,
(óptimo entre 70 y 100 células por campo a un aumento de 400X)
Es necesario CITOPLASMAS AMPLIOS, donde puedan distinguirse diferentes
patrones citoplasmáticos y el núcleo cláramente delimitado.
Debe poseer un NÚMERO CÉLULAS en diferentes fases del CICLO CELULAR.
Debe permitir ver un NÚMERO LIMITADO DE CROMOSOMAS (<10) con
claridad.
De 2-6 CROMOSOMAS en los cuales de 1-3 se encuentren en METAFASSE es lo
óptimo.
Debe tener una fluorescencia de fondo mínima.
 ANA / HEP2
Las células Hep2 se utilizan como sustrato ―Gold
standard‖ para screening de ANA
Células Hep2: cultivo de línea celular humana
derivada de un carcinoma laríngeo epitelial,
característicamente presenta mezcla de células
en reposo (interface) y células en división en
varias fases de la mitosis, que permiten
identificar estructuras nucleares.
La línea celular HEp-2 es un sustrato
recomendado para detectar anticuerpos
centrómeros, cuya presencia es altamente
indicativa de la variante CREST de la esclerosis
sistémica progresiva

Fuente: https://www.elsevier.es/es-revista-revista-colombiana-reumatologia-374-articulo-anticuerpos-anti-dfs70-un-nuevo-autoanticuerpo-S0121812318300306
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

El PATRÓN nos da una idea general de la especificidad de los anticuerpos

El TÍTULO es proporcional a la concentración de anticuerpos y nos da una aproximación

LIMITACIONES
Subjetividad de la técnica
Un patrón puede enmascarar otro y diferentes diluciones pueden dar diferentes patrones
Diferentes enfermedades puedan producir el mismo patrón
TITULACION DE IFI
Un alto título de ANA son clínicamente más significativo que un bajo título de ANA?
• Después del Umbral 1:80 o 1:160, el título de ANA tiene poco que ver con
el diagnóstico o actividad de la enfermedad.
• Patrón MOTEADO FINO DENSO no se asocia con un titulo bajo, hasta 1:120
en personas sanas.
• Puede ser importante en el establecimiento de un diagnóstico (Especificidad)
IMPORTANCIA DE PATRON
❑ Asociación clínica con Enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas
❑Posibles auto anticuerpos involucrados -->Direccionar el test según el algoritmo
para Anti-DNAds y anticuerpos específicos (ENA) posibles autoanticuerpos
involucrados.
❑Un análisis cuidadoso de patrón es útil para distinguir reactividad positiva
observada en los pacientes con enfermedades autoinmunes sistémicas y sin evidencia
de enfermedad autoinmune
LIMITACIONES DEL ENSAYO
1. Se pueden encontrar resultados positivos de ANA en personas
aparentemente sanas. Por lo tanto, es imperativo que tenga en cuenta la
condición clínica del paciente.
2. Los pacientes con LES que están recibiendo tratamiento con esteroides
pueden tener resultados de prueba negativos.
3. Muchos fármacos comúnmente recetados pueden inducir ANA.
4. Un patrón de autoanticuerpos puede oscurecer parcial o completamente
las características diagnósticas de otro patrón. En esos casos, es necesario
titular el suero.
5. No se pretende crear con este producto una asociación definitiva entre
el patrón de fluorescencia nuclear y cualquier estado de enfermedad
específico.
 AC – 0 NEGATIVO
Se considera negativo cuando no
existe estructuras celulares
claramente definidas y delimitadas
(subjetivo y semicuantitativo)
*Importante el tipo de sustrato
utilizado por los distintos
laboratorios, la dilución del suero,
conjugado y características del
microoscopio

Fuente: https://www.anapatterns.org/trees-full.php
 PATRONES NUCLEARES:

Fuente: https://www.anapatterns.org/trees-full.php
 AC-1 NUCLEAR HOMOGENEO
Antígenos dsADN, nucleosomas, histonas
Asociados
Enfermed LES, lúpus inducido por medicamentos,
ades artritis idiopática juvenil.
Asociadas
Descripció Fluorescencia homogénea y regular a
n través de todo el nucleoplasma, los
nucléolos pueden o no fluorecer
dependiendo del sustrato celular. Las
células en mitosis (metáfase, anáfase y
telófase) tienen la cromatina intensamente
fluorescente de manera homogénea.

Fuente: https://www.anapatterns.org/trees-full.php
 NUCLEAR GRANULARES AC-2,4,5,29
AC- 2
Sinónimo Nuclear punteado fino denso
Antígenos DFS70/LEDGF
Asociados
Enfermedades Raro en SSj, ES y LES
Asociadas
Descripción Patrón granular distribuido por todo
el núcleo de las células en interfase,
con heterogeneidad.
Algunas zonas más densas y más
débiles de los gránulos
La placa metafásica fuerte patrón
granular destacándose algunas
manchas gruesas.
Fuente: https://www.anapatterns.org/trees-full.php
AC-4
Nuclear punteado fino
SS-A/Ro, SS-B/La, Mi-2, TIF1?,
TIF1?, Ku
SSj, LES, dermatomiositis
Gránulos diminutos finos a través de
todo el nucleoplasma.
El nucléolo puede teñirse o no.
Las células mitóticas tienen la masa
de la cromatina no teñida.
AC-5
Nuclear punteado grueso,
Espliceosoma
hnRNP, U1RNP, Sm, ARN
polimerasa III
EMTC, LES, ES
Gránulos gruesos a través de
todo el nucleoplasma.
El nucléolo puede teñirse o no.
Las células mitóticas tienen la
masa de la cromatina no teñida.
 AC-3 NUCLEARES CENTROMERO
Sinonimo Cinetocoro

Antígenos CENP-A/B (C)

Asociados
Enfermeda ES cutánea limitada, CBP
des
Asociadas
Descripció Granular grueso discreto (40 ? 80/célula)
n dispersos en los núcleos de las células en
interfase y alineados en la masa de la
cromatina en las células mitóticas. Por
ejemplo anti-CENP-B

Fuente: https://www.anapatterns.org/trees-full.php
 PATRONES MEBRANA NUCLEAR
Membrana lisa AC-11
Enfermedades LES, SSj, artritis seronegativa
Antigenos Láminas A,B,C, o proteínas asociadas con las
láminas.
Descripcion Tinción homogénea del núcleo con intensidad en
la membrana nuclear externa.
Sin tinción en las placas de cromatina.
Se puede observar un peculiar aumento de
fluorescencia en los puntos de contacto entre
células adyacentes.
Fuente: https://www.anapatterns.org/trees-full.php
Membrana granular AC-12
CPB
Complejo de proteínas de los poros nucleares
La membrana con tinción punteada en células.
Aumento de fluorescencia en los puntos de
contacto entre células adyacentes.
No hay tinción en las placas de cromatina de la
metafase y anafase.