ELISA PARA HERPESVIRUS CANINO

Preparación de la placa

 Sensibilización de la placa

1.- Diluir la vacuna IBR, el ATCC de IBR y el virus Aujeszky 1:20 con PBS.

2.- Aplicar 50 µl de la dilución de vacuna, ATCC y virus en cada uno de los pozos de la placa
alternando las hileras de acuerdo al siguiente esquema. Usar como testigo el medio MEM diluido
1:20.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A VACUNA IBR
B ATCC IBR
C AUJESZKY
D TESTIGO
E VACUNA IBR
F ATCC IBR
G AUJESZKY
H TESTIGO

3.- Adicionar 50 µl de la solución carbonato bicarbonato en cada uno de los pozos e incubar en
refrigeración toda la noche.

4.- Decantar la placa y lavar 2 veces con solución de lavado para ELISA y una vez con agua destilada
(3 gotas por pozo o 300 µl) y secar sobre papel absorbente.

 Bloqueo de la placa

5.- Aplicar 150 µl de solución de grenetina al 0.25% y 150 µl de solución carbonato bicarbonato a
todos los pozos e incubar en refrigeración durante toda la noche.

6.- Decantar la placa y lavar 2 veces con solución de lavado para ELISA y una vez con agua
destilada (3 gotas por pozo o 300 µl) y secar sobre papel absorbente.

7.- La placa queda lista para usarse y se almacena en congelación.

 ELISA PARA HERPESVIRUS CANINO

PROCEDIMIENTO:

1.- Usar 4 pozos (1 de cada tipo) para cada suero problema. Agregar 100 µl del suero en cada pozo.

2.- Incubar 1 hora a 37ºC.

3.- Decantar la placa y lavar 2 veces con solución de lavado para ELISA y una vez con agua
destilada (3 gotas por pozo o 300 µl) y secar sobre papel absorbente.

4.- Aplicar a cada pozo 100 µl del conjugado canino diluido 1:1250 con regulador de citratos e
incubar a 37ºC durante 1 hora.

5.- Lavar de igual forma que en el paso 3.

6.-Aplicar 100 µl de solución desarrolladora de color (ver apéndice).

7.- Incubar durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente.

8.- Parar la reacción aplicando 50 µl de solución de paro.

9.- Leer en el lector de ELISA a 490 nm.

RESULTADO:
A la absorbancia de los pozos con virus se le resta la absorbancia del testigo y de acuerdo a esta
diferencia se determinan las Unidades ELISA.