Universidad Nacional de Colombia sede Palmira

Curso de Microbiología- Lab 5

Profesor: Alberto Rojas Triviño, Microbiólogo PhD.

Integrantes:

Nohemi Andrade López 120503

Olmes Andres Hernandez Ortiz 219038
Daniela Lozano Lores 0121035

Técnicas de recuento de microorganismos

OBJETIVOS.

- Capacitar al estudiante en las metodologías más utilizadas en microbiología, para la

cuantificación directa e indirecta de microorganismos.

- Desarrollar habilidades en los estudiantes para el recuento de las poblaciones de

microorganismos presentes en muestras de diferente origen.

INTRODUCCIÓN.

Existen diferentes técnicas para determinar el número de microorganismos o el peso seco

(biomasa), de las células microbianas presentes en un cultivo. Los métodos en general se
agrupan en directos o indirectos.

ACTIVIDAD PRÁCTICA.

Materiales y equipos: ● 1 stomacher o licuadora.

 ● 45 mL de agar SPC fundido y
mantenido a 45- 50°C.
● 1 recipiente de vidrio esterilizable
(o bolsas de polietileno para
stomacher).
● 1 baño de agua mantenido a 45 -
50°C.
● 1 balanza de precisión de 0.1g.
● 1 incubadora de 35±2°C.
Para preparación de muestras:
● 3 tubos con Agua Peptona 0.1%
estéril.
● 1 tubo con cultivo bacteriano de
24h en Caldo Nutritivo.
● 6 cajas Petri estériles.
● 1 caja Petri con cultivo fúngico de
3d en agar PDA.
● 3 cajas Petri con agar para
Standard Plate Count (SPC).
● 2 asas de vidrio o de hockey
estériles.
● 1 pipeta Pasteur pláticas estéril.

● Cuchilla y tijeras esterilizadas.

● 1 asa bacteriológica.
● 2 tubos con 10mL de Solución
● 1 contador de colonias.
Salina 0,85%.
● 9 pipetas de 1mL estériles.
● 1 cámara de Neubauer.
● 45 mL de agar OGY, Sabouraud,
● 1 microscopio binocular
PDA (para conteo de Mohos y
compuesto.
levaduras).
● 1 batería de patrones de
● 1 pipeta de 10 mL estéril.
McFarland.
● 1 calculadora.
● 1 espectrofotómetro.
● 1 mechero Bunsen.

PROCEDIMIENTO.

Recuento en placa profunda (o técnica de Barry), y placa en superficie.

- Realice inicialmente los cálculos de diluciones decimales iguales a 10-1, 10-2 y 10-3,
siguiendo las indicaciones de la guía y las indicaciones del tutor.

- Realice el proceso de dilución utilizando la muestra problema y el diluyente

apropiado, guiándose por los cálculos realizados anteriormente. Recuerde utilizar solo
material estéril en el procedimiento.

- Con las tres diluciones preparadas, proceda a inocular diferentes cajas Petri vacías y
con agar SPC (siembra en profundidad y en superficie).

- Para la siembra en profundidad: De la dilución 10-1, tome con una pipeta estéril de
1mL de capacidad, 1mL y colóquelo en una caja de Petri estéril; repita este procedimiento en
otra caja (cada dilución tendrá un duplicado), y de igual forma para las dos siguientes
diluciones.
- Cuando haya sembrado todas las cajas (seis cajas en total), proceda a verter agar
Standard Plate Count – SPC (Agar para conteo estándar), fundido y mantenido a 45°C
aproximadamente. Homogenice cada caja, realizando movimientos circulares y en ocho,
hasta que el agar inicie su polimerización.

- Para la siembra en superficie: De la dilución 10-1, tome con una pipeta estéril de
0,1mL de capacidad, 0,1 mL y colóquelo en la superficie de una placa de agar SPC y con asa
de vidrio, inmediatamente homogenice el inóculo por toda la superficie del agar; repita este
procedimiento en otra caja (cada dilución tendrá un duplicado), y de igual forma para las dos
siguientes diluciones.

- Recuerde que en la técnica en superficie, debe utilizar 0.1mL de la dilución y en la

técnica en profundidad 1 mL.

- Incube invertidas las cajas a 37±2°C. Revise las cajas a las 24 horas de incubación y
realice un recuento de las colonias visibles; incube nuevamente y revise a las 48h, realice el
recuento (Estas temperaturas y tiempos se aplican para el análisis de bacterias aerobias
mesófilas). Para el recuento de Mohos y Levaduras, aplique la misma técnica (profundidad y
superficie), e incube invertidas las cajas a 25°C por 3 a 5 días (al igual que en el recuento de
bacterias aerobias mesófilas, realice conteos a los 3 y posteriormente a los 5 días de
incubación).

- Con los datos obtenidos en los recuentos, proceda a realizar los cálculos, de acuerdo a
los volúmenes utilizados en la siembra y al factor de dilución de cada pareja de cajas.

- Reporte correctamente sus resultados del conteo de viables en UFC, por gramo o
mililitro, de acuerdo a la naturaleza de la muestra analizada.

Recuento en cámara de Neubauer.

- Revise los conceptos relacionados en esta práctica y siga las instrucciones

proporcionadas por su tutor.

- Verifique que la muestra se encuentre diluida, para proceder a calcular la

concentración de células por mililitro de muestra.

- Monte la cámara de Neubauer en el microscopio, localice la cuadrícula para conteo y

lleve a aumento de 10x. En este momento, debe observarse correctamente la cuadrícula y
comprender la distribución y las áreas a contar.

- Coloque el cubreobjetos de la cámara al borde de la misma y cubriendo la cuadrícula

de conteo.

- Homogenice en vórtex la muestra y con una pipeta Pasteur estéril, tome una alícuota
de la misma; permita que por capilaridad, la cámara absorbe la muestra.
- Verifique por observación, que la distribución de las células en la cámara sea
homogénea. Si no es así, realice nuevamente el montaje de la cámara.

- Proceda a realizar el conteo, registre sus datos y calcule la concentración de

células/mL.

1. Una vez se realice el cálculo de la cantidad de bacterias que se van a utilizar en los
experimentos, procedemos a desinfectar y esterilizar los materiales que se van a
utilizar en el laboratorio (figura 1); para realizar las siembras tanto en superficie como
en profundidad.
2. En un principio tomamos agua esterilizada una cantidad de 9ml, la cual lo ponemos
en un tubo de bisel.
3. Con la ayuda de una probeta, tomamos una muestra de 1 ml de bacterias que se
encuentran en estado líquido, la cual ponemos en el tubo de bisel que obtiene en un
principio los 9 ml de agua esterilizada ( este proceso lo llamamos dilución decimal
cerrado (figura inicial)), todo esto lo realizamos cerca de un mechero para que no se
nos contamine la muestra inicial; esta muestra la tomamos como base ya que de ahí
tomamos las siguiente muestra, así sucesivamente siguiendo la misma secuencia 3
veces (figura 2).

figura inicial: calcula de las bases a utilizar.

Figura 1: Materiales para el uso en el cultivo Figura 2: Toma de muestra (bacteria).
de superficie y profundidad.

4. Después de realizar cada una de las secuencias para cada tubo de bisel, se realiza un
clasificación para un fácil manejo al momento de realizar las diferentes disoluciones .

Figura 3: Clasificación de los tubos de bisel.

5. Una vez tengamos la clasificación iniciamos a preparar las disoluciones; tomamos en

un inicio una muestra de la bacteria, la cual corresponde a 1ml inicial la cual la
ponemos en un tubo bise que nos servirá de base para preparar las siguientes
disoluciones, este tubo de bisel tiene una cantidad de agua destilada de 9 ml, de la
cual mezclamos y volvemos a sacar 1ml de esa muestra y la ponemos en un segundo
tubo bisel el cual también contiene una cantidad de agua destilada de 9ml; así
sucesivamente hasta completar las cuatro disoluciones; tomando tan sólo 1 ml de cada
una de las muestras que se obtuvieron y colocándolo a una solución de 9 ml de agua
destilada.
Figura 4 y 5: preparación de los tubos de bisel con agua destilada y la toma de bacterias.

figura 6: preparación de la disolución figura 7: preparación de la disolución

figura 8: preparación de la disolución figura 9: disolucionador

 6. Después de realizar cada una de las secuencias para cada tubo de bisel, obtenemos
cuatro (4) muestras de compuestos diferentes concentraciones de muestras en
bacterias; de las cuales para realizar los cultivos tanto en profundidad como superficie
utilizamos las últimas tres (3) muestras, ya que la primera la utilizamos como base
para las otras (figura 10).

Figura 10: clasificación de las disoluciones con diferentes concentraciones de bacterias 2, 3,

4.

7. Una vez se tienen clasificadas las cantidades de bacterias que contienen cada tubo de
bisel, se realizan las diferentes siembras, iniciando por las de superficie, para esta
siembra se toma tres cajas petri en las cuales se realizan siembras con una cantidad de
0,1 ml de bacteria la cual se la toma con la ayuda de una probeta; una vez se ponga la
bacteria en la superficie del agar que contiene la caja petri con la ayuda de una asa de
hockey se realiza el esparcimiento de la bacteria en toda la base de la caja petri, este
proceso se repite para los tres cultivos, las muestras se toman cada una de un tubo de
bisel para cada caja petri, siguiendo el mismo procedimiento (figura 11, 12, 13).
figura 11: preparación de cultivo por figura 12: preparación de cultivo por superficie
superficie de 10-6 de 10-5

figura 13: preparación del cultivo por superficie de 10-4

8. una vez se termine la siembra de cultivo en superficie, iniciamos a realizar la siembra

por profundidad; de igual manera tomamos tres cajas petris en las cajas petri y con la
manipulación de la probeta tomamos 1 ml de las concentraciones que se encuentran
en los tubos de bisel, esta toma de igual manera la realizamos de manera descendente
( de mayor a menor con respecto a la disolución que tenemos en los tubos de bise), ya
que cada una contiene una concentración de bacterias diferente; de las siguiente
manera 10-5 10-4 10-3 (figura 14); una vez se tengan ya los aislados de las
bacterias procedemos aplicarles agar encima de ellas para las tres cajas petri (figura
15, 16), una vez se tenga distribuido el agar en las cajas petri movemos suavemente
los tres aislados hasta tener una contención del agar fija sobre la superficie de la caja
petri (figura 17).

Figura 14: proceso de siembra por profundidad, figura 15: contenido de agar.
en concentraciones de 10-5 10-4 10-3.
figura 16: distribución de agar en los tres figura 17: disolución del agar en toda la base
aislados preparados. de las cajas petri.

RESULTADOS.

● en profundidad:

figura 18: siembra por profundidad, figura 19: siembra por profundidad en
en concentraciones de 10-5 concentraciones de.10-4
figura 20: siembra por profundidad en
concentraciones de 10-3.

● en superficie

figura 21: resultado de la siembra cultivo figura 22: resultado del cultivo por superficie
de 10-6 de 10-5
figura 23: resultado del cultivo por superficie de 10-4

RECUENTO EN CÁMARA DE NEUBAUER.

Para este proceso de recuento en cámara de Neubauer de bacterias utilizamos; un
microscopio ( figura 1), una cámara de Neubauer (figura 2).

1. Como primero encendemos el microscopio ajustamos la luminosidad, verificamos que

todo esté en su orden.
figura 1: cámara de Neubauer figura 1: microscopio utilizado para el
recuento de bacterias.

2. seguido tomamos la cámara de neubauer, lo ajustamos a la platina del microscopio

una vez esté ajustado, le colocamos un cubreobjetos sobre la cámara Neubauer a una
altura aproximada de 0.1mm (figura 3); seguido aplicamos aceite de inserción (figura
4) y procedemos a realizar los análisis de lo que podemos observar por medio de los
objetivos (figura 5)

Figura 3: cámara Neubauer en la figura 4: aplicación del aceite de inserción.

platina, con el cubre objeto.
figura 5: análisis de la muestra

3. una vez tengamos fijado el objetivo con una muestra clara de las colonias que
podemos observar, iniciamos el proceso de reconteo; para este proceso escogemos 5
cuadrantes como los muestra la (figura 6); una vez identificados los cuadrantes a
estudiar los iniciamos a contar obteniendo los siguientes resultados (figura 7,8, 9,10,
11)

Figura 6: clasificación de cuadrantes. Figura 7: cuadrante estudiado (superior izq).

Figura 8: cuadrante estudiado (centro). figura 9: cuadrante estudiado (superior derec).

Figura 10: cuadrante estudiado (inferior izqu).

4. de la cual obtenemos los siguiente resultados en los cuadrantes (figura 12) y los
análisis realizados.

Figura 12: resultado de reconteo de los cuadrantes.

análisis:
● 48+60+46+36+34=230
● 230/5=46
● n=46

n=25*50*100
N=n*25*50*1000= 57.500.000

Este es resultado de las bacterias totales que se encontrarian esas colonias antes analizadas.

CUESTIONARIO.

1. Explique brevemente el proceso mediante el cual se realiza el recuento de

microorganismos por la técnica de tubos múltiples (o técnica del Número Más Probable -
NMP).

Este es un método de enumeración indirecto, que se basa en la interpretación estadística del

crecimiento, o no crecimiento,observado en varias series de tubos, inoculados con volúmenes
decrecientes de agua a analizar. Se debe preparar el número suficiente de diluciones de forma
que en la última dilución no se obtenga crecimiento de microorganismos, después de la
inoculación y la incubación correspondiente.

Preparación de las diluciones: La fracción de la muestra destinada para el análisis

microbiológico, debe de ser representativo de la población y constituida normalmente por
200 gramos o mililitros (esto dependiendo del análisis). Para la puesta en marcha, se utilizan
100 g o mL y el resto se almacena como reserva, por si se hace necesario repetir el recuento.
Si la muestra está constituida por distintos componentes, se tomarán fracciones
representativas de cada una de ellas en la superficie y en la profundidad de la misma.

Para casi todos los análisis, se parte de una suspensión líquida de concentración conocida,
que se denomina suspensión madre y que tiene una dilución 1:10 (10-1). Para conseguir este
factor de dilución, se mide una cantidad de muestra (en gramos o mililitros), y el resultante,
se multiplica por 9 (nueve). Este nuevo resultado serán los mililitros de diluyente que se debe
añadir a la muestra para lograr la dilución decimal. A partir de esta dilución, se preparan las
siguientes (1:100 ó 10-2, 1:1000 ó 10-3, etc.), hasta el factor requerido y establecido por el
analista; recuerde que siempre se debe tener la precaución de cambiar la pipeta entre la
realización de cada una de las diluciones y de mantener en frío, los tubos de la serie de
diluciones, hasta el comienzo de los análisis, pero sin prolongar por más de dos horas esta
refrigeración. Con la finalidad de realizar las diluciones con diferentes volúmenes o pesos de
las muestras y obtener diferentes factores de dilución, se puede hacer uso de la siguiente
fórmula: Factor de Dilución = Soluto/Solvente + Soluto

Donde, el soluto es la muestra (sólida o líquida), y el solvente es el diluyente utilizado.

Cálculo de la concentración: Las concentraciones de los organismos indicadores,

generalmente, se expresan en el número de microorganismos presentes por 100 ml de agua
original. Para obtener el NMP se siguen dos métodos que dan resultados equivalentes.
•Primer método: 1. De los datos tomados anteriormente se toma una terna (tres cifras
consecutivas), de manera que la última cifra sea cero. 2. Se determina el NMP para la terna
seleccionada en la tabla correspondiente. 3. Se multiplica este valor por el inverso de la
dilución central de la terna considerada. Así obtenemos la concentración de coliformes totales
por 100 ml de agua

• Segundo método: 1. De los datos, tomar una terna de forma que la cifra siguiente a la terna
considerada sea cero. 2. Obtener el valor del NMP para la terna deseada. 3. Multiplicar el
valor obtenido por el inverso de la dilución que corresponde a la cifra central de la terna. El
valor resultante será la concentración de CT/100 ml

2. Defina el término inóculo?

Se denomina inóculo a la concentración de microorganismos utilizada para realizar un cultivo

microbiano. La inoculación es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en
un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y
multiplicación.

BIBLIOGRAFÍA.

Aquiahuatl Ramos, M. A., y Pérez Chabela, M. L. 2004. Manual de prácticas del Laboratorio
de Microbiología General. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa.
México. Departamento de Biotecnología. 116 p.

Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial

Acribia. Zaragoza, España. 676 p.

Carrascal Camacho, A, K. Páez Morales, A., y Burbano Rosero, M. 2003. Manual de

Laboratorio: Microbiología de Alimentos. Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de
Ciencias, departamento de Microbiología, Bogotá. 171 p.
Castaño-Zapata, J. y Del Río Mendoza, L. 1997. Manual para el diagnóstico de hongos,
bacterias, virus y nematodos fitopatógenos. Zamorano- Universidad de Caldas. 210 p.

Food and Drug Administration (2009) [en línea]. USA: Department of Health & Human
Services FDA. [consultado ene., 2011]. Disponible en internet: <
http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalMa
nualBAM/defaul t.htm>

ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da

edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984.

Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. 2003. Brock: Biología de los Microorganismos.
Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid. 1011p.

Pelczar, M., y Chan, E.C.S. 1984. Elementos de Microbiología. Editorial MacGraw Hill,
México.