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PRCTICA ELISA I.

- INTRODUCCIN

El ELISA o Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay es un inmunoensayo que permite determinar la concentracin de un antgeno o un anticuerpo mediante el uso de uno de ellos en fase slida y el otro en solucin detectndose la formacin del complejo antgeno-anticuerpo mediante un trazador enzimtico. Esto se logra leyendo la densidad ptica de un producto de color en un espectrofotmetro. Esta tcnica utiliza anticuerpos que se han enlazado covalentemente a enzimas tal que quedan sin alteracin las propiedades catalticas del enzima y la especificidad del anticuerpo pero que al reaccionar con su sustrato dan como resultado un cambio de color detectable midiendo la absorbancia.

Los enzimas ms comnmente utilizadas son las siguientes: Peroxidasa, Fosfatasa alcalina, Galactosidasa. Estas enzimas tienen en comn que catalizan reacciones cuyos productos son de color y se pueden determinar en muy bajas concentraciones. En la prctica, el ELISA se hace en placas de microtitulacin que son pequeas bandejas de plstico con 96 pozos hechos de polipropileno y materiales plsticos transparentes. Las protenas, el antgeno o el anticuerpo, se adhieren a la superficie como resultado de interaccin hidrofbica de las protenas y la superficie plstica no polar. Esta fijacin es estable ante lavados varios con diferentes reactivos.

Las Interleucinas son citocinas que desempean un papel importante en la defensa del hospedero, respuesta inmune, hematopoyesis entre otros. Es expresado por una variedad de clulas normales, transformadas. La produccin de TNF- es sobre regulado por numerosas seales, por estimulacin, lipopolisacaridos, ionoforos de calcio, citocinas y virus. Elevados niveles de TNF- se han observado en numerosas condiciones patolgicas, incluyendo infecciones de bacterias y virus, traumatismo, enfermedades autoinmune y de tipo malignas.

Principios de la prctica Este ensayo emplea la tcnica cuantitativa enzimtica de sandwich. Un anticuerpo monoclonal especfico para IL-6 ha sido precubierto en una microplaca. Los estandares, el control, y las muestras son pipetedas en los pozos y si la IL-6 se encuentra presente, es inmovilizada por el anticuerpo primario. Despus se dan unos lavados, seguido se une a una anticuerpo policlonal especfico para IL-6 (Ac. Secundario) el cual se aade a los pozos. Despus se le da un lavado, y se agrega una solucin de sustrato a los pozos. La reaccin produce un producto coloreado (verde, verde azulado) cuya intensidad est en proporcin por la cantidad de IL-6 presente. Los valores de la muestra entonces son ledos en la curva estndar.

II.- OBJETIVO DE LA PRCTICA El alumno comprender los fundamentos y desarrollara una prueba de ELISA para la determinacin de interleucina 6, as como el anlisis e interpretacin de los resultados.

III.- MATERIAL Y MTODOS Material Biolgico Sangre perifrica

Material y Reactivos Estuche comercial para la deteccin de TNF- por el mtodo de ELISA Agua demonizada o Destilada Tubos secos de tapn rojo Jeringas de 5 mL Puntas para micropipeta (1-200L y 1-1000 L) Microtubos 1.5mL Tubos cnicos de 15 mL Pipetas de 5 mL Pipetas de 10 mL Guantes Cubrebocas Algodn PBS 1X (Na2HPO4, NaCl, KH2PO4, KCl) Tween 20 BSA (Bovine serum albumine) ABTS cido ctrico anhidro NaOH H2O2 Placas para ELISA Canaletas para reactivos o cajas de Petri.

Equipo Micropipetas (1-200L y 1-1000 L Placa oscilatoria Pipeta Multicanal Centrifuga Lector de microplacas de ELISA

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Preparacin previa de placa de reaccin (previamente realizado) 1. Trabajar los reactivos a la temperatura ambiente antes del empleo. 2. Diluir el anticuerpo de captura (anti-TNF-) con PBS para obtener una concentracin de 2 g/mL. Agregar 100 L a cada pozo. Sellar la placa e incubar toda la noche a temperatura ambiente. 3. Aspirar y lavar cada pozo, repitiendo el proceso cuatro veces, agregando 300 L de PBS/Tween 20 0.5% a cada pozo y quitar cualquier restante por aspirando o decantando. Invierta la placa, dar unos golpecitos toallitas de papel limpia. 4. Agregar 300 L de buffer de bloqueo (PBS-BSA 1%). Incubar 30 min a temperatura ambiente. 5. Aspirar y lavar cada pozo, repitiendo el proceso tres veces, agregando 300 L de PBS/Tween 20 0.5% a cada pozo y quitar cualquier restante por aspirando o decantando. Invierta la placa, dar unos golpecitos toallitas de papel limpia. 6. Reconstituir el control de TNF- a concentraciones de 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562, 0.7812 y 0 ng/mL con PBS/BSA 1%. Agregar 100 L a cada pozo del estndar por triplicado y de las muestras por duplicado. Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 7. Aspirar y lavar cada pozo, repitiendo el proceso tres veces, agregando 300 L de PBS/Tween 20 0.5% a cada pozo y quitar cualquier restante por aspirando o decantando. Invierta la placa, dar unos golpecitos contra toallitas de papel limpia. 8. Agregar el anticuerpo de deteccin a una concentracin de 0.5g/mL en PBS/BSA 1%. Agregar 100 L a cada pozo e incubar 30 minutos a temperatura ambiente. 9. Aspirar y lavar cada pozo, repitiendo el proceso tres veces, agregando 300 L de PBS/Tween 20 0.5% a cada pozo y quitar cualquier restante por aspirando o decantando. Invierta la placa, dar unos golpecitos toallitas de papel limpia. 10. Agregar el conjugado Avidina-HRP (1:2000) en PBS/BSA 1%. Agregar 100 L a cada pozo e incubar 30 minutos a temperatura ambiente. contra contra contra

11. Aspirar y lavar cada pozo, repitiendo el proceso tres veces, agregando 300 L de PBS/Tween 20 0.5% a cada pozo y quitar cualquier restante por aspirando o decantando. Invierta la placa, dar unos golpecitos toallitas de papel limpia. 12. Agregar 100 L de la solucin de sustrato-ABTS a cada pozo e incubar de 10-40 minutos a temperatura ambiente hasta observar el desarrollo de color. 13. Leer la placa a 405 nm en u nlector de placas e interpolar los resultados con la curva stardard. contra

V.- CONCEPTOS QUE EL ALUMNO DEBER INVESTIGAR ANTES DE INGRESAR AL LABORATORIO Y ANEXAR EN SU REPORTE DE LA PRCTICA a) Cules variantes de ELISA existen y cules son sus diferencias? b) Qu factores pueden afectar el desarrollo de una prueba de ELISA provocando falsos positivos o falsos negativos? c) Cuales son las principales aplicaciones de las tcnica de ELISA?

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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