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CUANTIFICACIN DE BACTERIAS POR RECUENTO DE COLONIAS EN PLACA

I. INTRODUCCIN
El recuento de colonias en placa es un mtodo muy utilizado cuando se necesita
determinar el tamao de la poblacin bacteriana de una muestra. El recuento de
microorganismos, en este caso, se basa en que cada uno desarrollar una colonia visible.
Pero debido a que una muestra no es totalmente homognea con respecto a su
composicin microbiolgica, es posible que una colonia se origine de un microorganismo o
de cientos de ellos, dando en este ltimo caso un recuento menor del real.
Tambin es posible que muchas de las bacterias presentes en la muestra no puedan
crecer en las condiciones elegidas (pH, temperatura, medio de cultivo, tiempo, etc.). En
este caso el recuento tambin ser inferior al real. Lo que si se sabe es que cada colonia
observada se form a partir de por lo menos un microorganismo. Esta es una condicin
necesaria y suficiente. Entonces la colonia es considera una unidad formadora de colonia
(ufc) a los efectos de los clculos. Se admite, por lo tanto, que en los mtodos de recuento
de microorganismos vivos, son inevitables los errores. Especialmente cuando se examinan
muestras pequeas, es posible cometer grandes errores.
El recuento con cmara de Petroff-Hauser o Hemocitmetro, consiste en colocar una
diminuta gota de cultivo en un portaobjetos especial (hemocitmetro); La muestra queda
depositada en un espacio de 0,1 mm entre el portaobjeto y el cubreobjeto; La excavacin
completa tiene 25 cuadrados cada uno dividido en 16 cuadrados ms pequeos; Para
calcular el nmero de clulas por ml de muestra, se utiliza la ecuacin:
(N cel/ml = X cel x 25 xDx 10000), este recuento representa la cantidad de clulas
vivas y muertas. El mtodo es aplicable a cualquier suspensin de partculas
microscpicas.
II. OBJETIVOS
- Determinar el nmero de microorganismos por el mtodo de recuento en
placa
- Determinar el nmero de microorganismos por microscopia
III.

MATERIALES
- Muestras: suelo, de levaduras, cepa de E. coli, etc.
- Vaso de precipitados, tubos de ensayo, pipetas, asa de drigasky,
IV. PROCEDIMIENTO
1. Recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) en placa
Preparar una suspensin de E. coli en un tubo de ensayo conteiendo 5 ml de SSF o
agua esteril.
Agitar el tubo de ensayo.
Preparar diluciones seriadas de 1/10, 1/ 100, 1/ 1.000, 1/ 10.000 y 1/ 100.000 de la
suspensin anterior.
Rotular 3 placas (para las ltimas diluciones)

Sembrar 0.1 ml de cada dilucin en una placa de Petri con Agar Nutritivo y con ayuda
de una asa de Digralski extenderlo por toda la placa.
Incubar a 37 C durante 2- 3 das en estufa o incubadora.
Realizar el recuento microbiano (escoger placas que muestren entre 30 y 300
colonias). Dar el resultado en UFC/g.= N de colonias en placa (entre 30 y 300) x
inverso de la dilucin x 10
1. Recuento de colonias en placa
Preparar una suspensin al 10 % de suelo (tierra seca y recin recogida) en 50 ml. de
agua destilada.
Agitar la suspensin anterior durante 30 a 60 minutos.
Preparar diluciones seriadas de 1/10, 1/ 100, 1/ 1.000, 1/ 10.000 y 1/ 100.000 de la
suspensin anterior.
Rotular 5 placas (una para cada dilucin) sembrar 0.1 ml (con pipeta limpia en cada
una) de cada dilucin en una placa de Petri con Agar Nutritivo y con ayuda de una asa
de Digralski extenderlo por toda la placa.
Incubar a 37 C durante 2- 3 das en estufa o incubadora.
Observar las placas en busca de efectos de inhibicin.
Realizar el recuento de los microorganismos presentes en la muestra del suelo. Para
realizar el contaje se escogen las placas que muestren entre 30 y 300 colonias. Para
visualizar mejor es conveniente ubicar la placa sobre una caja con tapa de vidrio y luz,
dividiendo la superficie total de la placa en sectores cuadriculados. Dar el resultado en
ufc/g (no en bacterias por gramo):
Ufc/g = N de colonias en placa (entre 30 y 300) x inverso de la dilucin x 10
2. Recuento con cmara de Petroff-Hauser o Hemocitmetro.
- Con ayuda de un gotero tomar una muestra liquida conteniendo microorganismos.
- Colocar con mucho cuidado una pequea cantidad de muestra entre la lmina y la
laminilla.
- Contar las clulas presentes en varios cuadrados grandes y sacar un promedio.
- usar la ecuacin para determinar el nmero de cel/ml: N cel/ml = X cel x 25 x D x
10000
V. CUESTIONARIO
1. Qu permite determinar el estudio cuantitativo de bacterias?
2. Qu tipo de muestras se pueden analizar?
3. Mencione las limitaciones del mtodo del recuento de colonias en placa.
4. Ventajas y desventajas del recuento microscpico
5. Describa cmo obtendra una dilucin de 10 -8 de la muestra a analizar en tubos de 5
ml. Y cuantos microorganismos esperara contar.