PRACTICA No.

3 HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN POR AMILASA VEGETAL OBJETIVO: Determinar la presencia de enzimas hidrológicas durante la germinación por el método colorimétrico tomado como factor el tiempo de actividad enzimática. MATERIAL: -tubos de ensayo de (16 x 150) -gradillas -pipetas graduadas de 1ml (plástico) -pipeta de 5 o 10 ml -vaso de precipitado de 250 ml -mechero -soporte universal con anillo -embudo de plástico -mortero de porcelana con pistilo -vaso de precipitado -pipeta de 1 ml -balanza granataria -espectrofotómetros -Celdas -Semillas de maíz, frijol o lenteja de 7-8 días de germinación -plumón indeleble. -jabón y franela para limpiar -hielo -sobres de gasa -Masking tape -ligas REACTIVOS: -solución de glucosa al 0.1 % -agua destilada -acido 3,5- Dinitrosalicilico (DNS) en frasco ámbar -solución de yodo (I2KL en una solución de HCL 0.05 N) en frasco ámbar. -Solución de CaCl2 20 mM – NaCl 200 mM -solución de almidón al 0.2% -solución Buffer pH 5 En esta parte de la práctica habrá 5 equipos en los cuales dos trabajaron con amilasa extraída, dos con amilasa pura y el último equipo hará la curva de calibración de glucosa.

4.2% en buffer pH 5 4ml Solución CaCl-NaCl 4ml .. 3..-Se molió todo dentro del mortero usando como solvente 3 mililitros de agua destilada por cada gramo de tejido.-Se diluyo lo obtenido en una solución 1: 10 con solución amortiguadora de acetato pH 5. se pusieron todo dentro de un recipiente y se peso en la balanza granataria. 5. 2. 6. de todo tipo de semillas y lavarlas para quitar las impurezas.-Se filtro la molienda con ayuda del embudo y de dos capas de gasa. manteniéndolo a una temperatura más baja que la ambiente. Y se dejo sedimentar.-Se preparo en dos tubos de ensaye (13 x 150 mm) de la siguiente manera: Tubo AyB Almidón 0.-Se paso lo filtrado en un tubo de ensaye. Se le quito la parte más blanca de la semilla que sería la raíz y parte del tallo. con ayuda de hielo.METODO: 1. pero se siguió manteniendo frio.

7. 6. 5. se fue agregando a cada tubo 1 ml de la enzima.483 3 0. . 2. Se pusieron a calentar los tubos durante 10 minutos a baño maría. calibrando la densidad óptica con el tubo blanco.-Agitar 5. en otras palabras por cada 5 minutos después del primero que era en tiempo 0.-Se grafico la absorvancia a 620mm contra tiempo de reacción. 7. absorvancia contra tiempo de reacción. incluyendo al tubo para calibrar ya que se sedimenta.-El primer tubo (tiempo 0) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos. con mucho cuidado para no afectar el rango de tiempo.664 0.419 0. a cada tubo se le agrego un mililitro de la enzima diluida (extraída) a cada tubo que tiene la solución de yodo. se tomo 1 ml del tubo que contiene la enzima diluida y se agrego a cada uno de los tubos que contienen solución de DNS.5 .-A un tubo se le agrego 3 ml de agua destilada. 6.452 2 0. 3. 8. a calentar hasta hervir (que salgan burbujitas) y con los tubos se unieron con ligas para evitar que se fueran de lado y se cayeran. y se correlaciono con el cambio de color de la serie B.563 5 6 7 8 9 0.ENSAYO A 1. RESULTADOS: TUBO 0 APARICIÓN 0 DE GLUCOSA 1 0.-A continuación se graficaron los datos. 9.452 0.Dinitrosalicilico) 2.-Correlacione los datos obtenidos con el cambio de color con la solución de yodo. a este se le llamara tubo blanco este servirá para calibrar al espectrómetro al 100% de trasmitancia o cero de absorvancia (densidad óptica).-Se coloco en una celda los 11 tubos de ensaye para leerlos en el espectrofotómetro a una absorbencia de 620mm.-Al primer tubo (tiempo O) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos.201 ENSAYO B 1.-Se le agrego a cada tubo 8ml de agua destilada y se agito.-Se prepararon diez tubos de ensaye (13 x 150 mm) agregando a cada uno 1 ml de la solución de yodo. 4.-Adicione 2 ml de agua destilada a un tubo que servirá para calibrar 575 nm en el espectrofotómetro a 100% de transmitancia o cero de absorvancia (densidad óptica) 3.526 0. 4. En el cual el tubo blanco (paso 2) se utilizo primero para calibrar a una absorvancia óptica de 0.-Se dejaron enfriar los tubos a temperatura ambiente ya que podría romperse el tubo si se cambia bruscamente la temperatura.-Se le agrego a cada tubo 2 ml de agua destilada y se agito con cuidado de no romper el tubo.552 4 0.-Se tomo lectura en el espectrofotómetro a una absorvancia de 575nm cada uno.-Se prepararon 10 tubos de ensaye (13 x 150mm) agregando a cada uno 1ml de la solución de DNS (ácido 3.-En un recipiente de precipitación se puso agua del grifo. Y a continuación se leyeron cada uno y se anotaron los resultados.

-Se prepararon diez tubos de ensaye (13 x 150 mm) agregando a cada uno 1 ml de la solución de yodo.015 2 0.027 5 6 7 8 9 0.045 0.494 3 0.032 0. 4. Y a continuación se leyeron cada uno y se anotaron los resultados.-Se grafico la absorvancia a 620mm contra tiempo de reacción.502 0. y se correlaciono con el cambio de color de la serie D.466 5 6 7 8 9 0.520 0.2% en buffer pH Solución CaCl-NaCl 5 CyD 4ml 4ml ENSAYO C 1.-Agitar 5.454 2 0. el tubo de ensaye se coloco en un recipiente con hielo.-A un tubo se le agrego 3 ml de agua destilada.-El primer tubo (tiempo 0) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos.024 3 0. 7.576 0. esta se puso en un tubo de ensaye (13 x 150 mm).504 4 0.-Se coloco en una celda los 11 tubos de ensaye para leerlos en el espectrofotómetro a una absorbencia de 620mm. En el cual el tubo blanco (paso 2) se utilizo primero para calibrar a una absorvancia óptica de 0.RESULTADOS: TUBO 0 APARICIÓN 0 DE AMILASA EXTRAÍDA 1 0. a cada tubo se le agrego un mililitro de la enzima pura a cada tubo que tiene la solución de yodo. a este se le llamara tubo blanco este servirá para calibrar al espectrómetro al 100% de trasmitancia o cero de absorvancia (densidad óptica). 6.-Se le agrego a cada tubo 2 ml de agua destilada y se agito con cuidado de no romper el tubo. A continuación se diluyo (a la tercera vez) en una solución 1:100 con una solución amortiguadora de acetato pH 5.528 ENSAYO D .041 0. RESULTADO: TUBO 0 APARICIÓN 0 DE GLUCOSA 1 0. Se preparo en dos tubos de ensaye (13 x 150 mm) de la siguiente manera: Tubo Almidón 0. 2.022 4 0.043 0.488 0.068 POR OTRA PARTE………… Se está trabajando con la amilasa pura. 3. pero aun manteniéndolo al frio.

00 3 .-Se dejaron enfriar los tubos a temperatura ambiente ya que podría romperse el tubo si se cambia bruscamente la temperatura.-Adicione 2 ml de agua destilada a un tubo que servirá para calibrar 575 nm en el espectrofotómetro a 100% de transmitancia o cero de absorvancia (densidad óptica) 3. 8. RESULTADO: TUBO DESAPARICIÓ N DE AMILASA 0 1 0 0. 5.81 2 3 0. absorvancia contra tiempo de reacción. a calentar hasta hervir (que salgan burbujitas) y con los tubos se unieron con ligas para evitar que se fueran de lado y se cayeran.-En un recipiente de precipitación se puso agua del grifo.1.16 4 6 0. 9.-Al primer tubo (tiempo O) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos. se tomo 1 ml del tubo que contiene la enzima pura y se agrego a cada uno de los tubos que contienen solución de DNS. 4.-Se tomo lectura en el espectrofotómetro a una absorvancia de 575nm cada uno. 1 7 0. 6.Dinitrosalicilico) 2.-A continuación se graficaron los datos.2 9 9 0.-Correlacione los datos obtenidos con el cambio de color con la solución de yodo.98 1 2 0.-Se le agrego a cada tubo 8ml de agua destilada y se agito. 7. calibrando la densidad óptica con el tubo blanco.51 8 4 0.01 6 10 0.32 0 5 0.-Se prepararon 10 tubos de ensaye (13 x 150mm) agregando a cada uno 1ml de la solución de DNS (ácido 3. incluyendo al tubo para calibrar ya que se sedimenta. Se pusieron a calentar los tubos durante 10 minutos a baño maría.5 .07 3 8 0.

Y por ultimo.-Se tomo lectura en el espectrofotómetro a una absorvancia de 575nm cada uno.243 5 0.6ml 1ml 5 0.9ml 1ml 3 0. de igual manera de menor a mayor. en el tubo uno se adiciona 0ml de glucosa.018 2 0.6ml de glucosa.-En un recipiente de precipitación se puso agua del grifo. Se pusieron a calentar los tubos durante 10 minutos a baño maría.-Se agrego agua destilada.8ml de glucosa y al tubo siete 1ml de glucosa. en el tubo dos 0.1%. al tubo tres 0. incluyendo al tubo para calibrar ya que se sedimenta.8ml 0. 5. 4.-Al primer tubo (tiempo O) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos. INCLUYENDO EL COEFICIENTE DE COORELACIÓN (r) Solución Glucosa 0. a calentar hasta hervir (que salgan burbujitas) y con los tubos se unieron con ligas para evitar que se fueran de lado y se cayeran. calibrando la densidad óptica con el tubo blanco. en el tubo uno se le agrego 1ml.4ml 1ml 6 0. al tubo cinco 0. en el tubo 2 se le agrega 0.324 6 0.-Correlacione los datos obtenidos con el cambio de color con las graficas de desaparición de glucosa. la glucosa es al 0. 8.4ml.6ml 0.160 4 0. el tubo seis 0.4ml de glucosa. 6. al tubo cinco 0. RESULTADO: TUBO 0 CURVA 0 PATRO N DE GLUCO SA 1 0.2ml 0.6ml. al tubo seis 0.2ml y en el tubo siete 0ml.2ml de glucosa. 7.380 .1% Agua Destilada Reactivo DNS 1 0ml 1ml 1ml 2 0. absorvancia contra tiempo de reacción.8ml.4ml 0. al tubo cuatro 0. de menor a mayor.-A continuación se graficaron los datos. 9.1ml de glucosa.9ml. METODO PARA ELABORAR LA CURVA DE CALIBRACIÓN CON GLUCOSA QUE SERVIRA COMÓ PATRÓN PARA HACER EL ANÁLISIS DE REGRESIÓN LINEAL.2ml 1ml 7 1ml 0ml 1ml 1.8ml 1ml 4 0. el tubo tres 0.-Se le agrego a cada tubo 8ml de agua destilada y se agito.088 3 0.1ml 0. 3. se le agrega 1ml de solución de DNS. al tubo cuatro 0.-Se dejaron enfriar los tubos a temperatura ambiente ya que podría romperse el tubo si se cambia bruscamente la temperatura.-Se prepararon 7 tubos de ensaye (13 x 150mm) agregando a cada uno. 2.

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ANEXOS: .

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tiene dos tipos de polímeros de glucosa los que constituyen el almidón ya que se trata de una mezcla de dos compuestos: •la amilosa (30 %) es una molécula lineal de glucosa con elaces glucosidicos (1-4) sin ramificar. pH.Siempre y cuando haya sustrato disponible. un aumento en la concentración de la enzima aumenta la velocidad enzimática hacia cierto límite.Un incremento de 10°C duplica la velocidad de reacción. es necesaria para la síntesis de glucosa para que pueda obtener energía la misma semilla apartir de sus reservas energéticas. 3. y es una aldosa.. raíz y tallo). 5. Temperatura. Presencia de cofactores. y cuál relación hay entre ellas? la glucosa es una hexosa. El almidón es un polímero hecho de glucosa que se utiliza como sustancia de reserva en las plantas...¿Cómo se distingue bioquímicamente la degradación del almidón por amilasa y por Fosforilasa? Por amilasa lo que hace con el almidon es romperlo en azucares mas simples.¿Cuáles son las condiciones que alteran las funciones de las enzimas? Concentración del sustrato. mientras que la fosforilasa va quitando de uno en uno la glucosa de las cadenas.CUESTIONARIO: 1. hasta ciertos límites. esto es.¿A qué grupo pertenece la enzima amilasa vegetal? De tipo exohidrolasa especifica 2. usando estas reservas mientras desarrolla sus órganos (hoja. .. a una concentración fija de la enzima se obtiene la velocidad máxima. Después de que se alcanza esta velocidad. la concentración del cofactor debe ser igual o mayor que la concentración de la enzima para obtener una actividad catalítica máxima.¿Qué diferencia bioquímica existe entre glucosa y almidón... la enzima pierde su actividad.El pH óptimo de la actividad enzimática optima es de 7 una variación de este pH varia la velocidad de reacción o la desnaturalización de la enzima. un aumento en la concentración del sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reacción. sean activadores o coenzimas para funcionar adecuadamente. el grupo carbonilo está en el extremo de la molécula... 4. es decir.¿Por qué aparece la enzima en el germinado de maíz? La actividad enzimática.A mayor concentración del sustrato. que contiene 6 átomos de carbono..Muchas enzimas dependen de los cofactores. Concentración de la enzima. El calor es un factor que desnaturaliza las proteínas por lo tanto si la temperatura se eleva demasiada. •la amilopectina (70 %) también adopta una posición helicoidal similar a la amilosa pero posee ramificaciones laterales originadas mediante enlaces a (1-6) cada 12 moléculas de glucosa.. Para las enzimas que tienen cofactores.

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