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3° practica Hidrolisis del almidon

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PRACTICA No.

3 HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN POR AMILASA VEGETAL OBJETIVO: Determinar la presencia de enzimas hidrológicas durante la germinación por el método colorimétrico tomado como factor el tiempo de actividad enzimática. MATERIAL: -tubos de ensayo de (16 x 150) -gradillas -pipetas graduadas de 1ml (plástico) -pipeta de 5 o 10 ml -vaso de precipitado de 250 ml -mechero -soporte universal con anillo -embudo de plástico -mortero de porcelana con pistilo -vaso de precipitado -pipeta de 1 ml -balanza granataria -espectrofotómetros -Celdas -Semillas de maíz, frijol o lenteja de 7-8 días de germinación -plumón indeleble. -jabón y franela para limpiar -hielo -sobres de gasa -Masking tape -ligas REACTIVOS: -solución de glucosa al 0.1 % -agua destilada -acido 3,5- Dinitrosalicilico (DNS) en frasco ámbar -solución de yodo (I2KL en una solución de HCL 0.05 N) en frasco ámbar. -Solución de CaCl2 20 mM – NaCl 200 mM -solución de almidón al 0.2% -solución Buffer pH 5 En esta parte de la práctica habrá 5 equipos en los cuales dos trabajaron con amilasa extraída, dos con amilasa pura y el último equipo hará la curva de calibración de glucosa.

6. pero se siguió manteniendo frio.METODO: 1.-Se filtro la molienda con ayuda del embudo y de dos capas de gasa.-Se preparo en dos tubos de ensaye (13 x 150 mm) de la siguiente manera: Tubo AyB Almidón 0. se pusieron todo dentro de un recipiente y se peso en la balanza granataria.-Se diluyo lo obtenido en una solución 1: 10 con solución amortiguadora de acetato pH 5. 3.2% en buffer pH 5 4ml Solución CaCl-NaCl 4ml . 5. Y se dejo sedimentar. 4.-Se paso lo filtrado en un tubo de ensaye.-Se molió todo dentro del mortero usando como solvente 3 mililitros de agua destilada por cada gramo de tejido. 2. de todo tipo de semillas y lavarlas para quitar las impurezas. manteniéndolo a una temperatura más baja que la ambiente. Se le quito la parte más blanca de la semilla que sería la raíz y parte del tallo.. con ayuda de hielo..

-A un tubo se le agrego 3 ml de agua destilada. en otras palabras por cada 5 minutos después del primero que era en tiempo 0.-Se dejaron enfriar los tubos a temperatura ambiente ya que podría romperse el tubo si se cambia bruscamente la temperatura.Dinitrosalicilico) 2.-Correlacione los datos obtenidos con el cambio de color con la solución de yodo.664 0. y se correlaciono con el cambio de color de la serie B.-Se coloco en una celda los 11 tubos de ensaye para leerlos en el espectrofotómetro a una absorbencia de 620mm.552 4 0. 4. a este se le llamara tubo blanco este servirá para calibrar al espectrómetro al 100% de trasmitancia o cero de absorvancia (densidad óptica). 4.-Se tomo lectura en el espectrofotómetro a una absorvancia de 575nm cada uno.-Se prepararon 10 tubos de ensaye (13 x 150mm) agregando a cada uno 1ml de la solución de DNS (ácido 3.452 2 0.-Se le agrego a cada tubo 8ml de agua destilada y se agito. 6.-Adicione 2 ml de agua destilada a un tubo que servirá para calibrar 575 nm en el espectrofotómetro a 100% de transmitancia o cero de absorvancia (densidad óptica) 3.-En un recipiente de precipitación se puso agua del grifo. 7. En el cual el tubo blanco (paso 2) se utilizo primero para calibrar a una absorvancia óptica de 0. absorvancia contra tiempo de reacción. se tomo 1 ml del tubo que contiene la enzima diluida y se agrego a cada uno de los tubos que contienen solución de DNS.-Se grafico la absorvancia a 620mm contra tiempo de reacción.-Al primer tubo (tiempo O) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos. se fue agregando a cada tubo 1 ml de la enzima. 3. RESULTADOS: TUBO 0 APARICIÓN 0 DE GLUCOSA 1 0.-Se le agrego a cada tubo 2 ml de agua destilada y se agito con cuidado de no romper el tubo. 9. Se pusieron a calentar los tubos durante 10 minutos a baño maría.452 0. 2.ENSAYO A 1.201 ENSAYO B 1. . a cada tubo se le agrego un mililitro de la enzima diluida (extraída) a cada tubo que tiene la solución de yodo.483 3 0. 7. 6. a calentar hasta hervir (que salgan burbujitas) y con los tubos se unieron con ligas para evitar que se fueran de lado y se cayeran.526 0. 8. Y a continuación se leyeron cada uno y se anotaron los resultados.563 5 6 7 8 9 0.419 0.-El primer tubo (tiempo 0) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos.5 . incluyendo al tubo para calibrar ya que se sedimenta.-Se prepararon diez tubos de ensaye (13 x 150 mm) agregando a cada uno 1 ml de la solución de yodo. calibrando la densidad óptica con el tubo blanco. con mucho cuidado para no afectar el rango de tiempo. 5.-A continuación se graficaron los datos.-Agitar 5.

015 2 0.045 0.466 5 6 7 8 9 0.488 0. En el cual el tubo blanco (paso 2) se utilizo primero para calibrar a una absorvancia óptica de 0.024 3 0. 2. A continuación se diluyo (a la tercera vez) en una solución 1:100 con una solución amortiguadora de acetato pH 5.-Se grafico la absorvancia a 620mm contra tiempo de reacción. 7.2% en buffer pH Solución CaCl-NaCl 5 CyD 4ml 4ml ENSAYO C 1.041 0. esta se puso en un tubo de ensaye (13 x 150 mm). 4. Se preparo en dos tubos de ensaye (13 x 150 mm) de la siguiente manera: Tubo Almidón 0.494 3 0.504 4 0.027 5 6 7 8 9 0.502 0. a cada tubo se le agrego un mililitro de la enzima pura a cada tubo que tiene la solución de yodo. RESULTADO: TUBO 0 APARICIÓN 0 DE GLUCOSA 1 0.454 2 0.068 POR OTRA PARTE………… Se está trabajando con la amilasa pura.-Se prepararon diez tubos de ensaye (13 x 150 mm) agregando a cada uno 1 ml de la solución de yodo.-Se le agrego a cada tubo 2 ml de agua destilada y se agito con cuidado de no romper el tubo. 3.043 0. 6. y se correlaciono con el cambio de color de la serie D. a este se le llamara tubo blanco este servirá para calibrar al espectrómetro al 100% de trasmitancia o cero de absorvancia (densidad óptica).520 0.-El primer tubo (tiempo 0) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos.032 0.-Agitar 5.-A un tubo se le agrego 3 ml de agua destilada. pero aun manteniéndolo al frio.528 ENSAYO D .-Se coloco en una celda los 11 tubos de ensaye para leerlos en el espectrofotómetro a una absorbencia de 620mm.RESULTADOS: TUBO 0 APARICIÓN 0 DE AMILASA EXTRAÍDA 1 0. Y a continuación se leyeron cada uno y se anotaron los resultados. el tubo de ensaye se coloco en un recipiente con hielo.576 0.022 4 0.

1 7 0. 7.81 2 3 0. incluyendo al tubo para calibrar ya que se sedimenta. a calentar hasta hervir (que salgan burbujitas) y con los tubos se unieron con ligas para evitar que se fueran de lado y se cayeran.-A continuación se graficaron los datos.32 0 5 0.5 . calibrando la densidad óptica con el tubo blanco.01 6 10 0.16 4 6 0. 8.-Se prepararon 10 tubos de ensaye (13 x 150mm) agregando a cada uno 1ml de la solución de DNS (ácido 3.-Correlacione los datos obtenidos con el cambio de color con la solución de yodo.-Adicione 2 ml de agua destilada a un tubo que servirá para calibrar 575 nm en el espectrofotómetro a 100% de transmitancia o cero de absorvancia (densidad óptica) 3. 5.2 9 9 0.1.-En un recipiente de precipitación se puso agua del grifo. absorvancia contra tiempo de reacción.Dinitrosalicilico) 2.-Al primer tubo (tiempo O) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos.51 8 4 0.-Se tomo lectura en el espectrofotómetro a una absorvancia de 575nm cada uno.98 1 2 0. 9. 4.-Se dejaron enfriar los tubos a temperatura ambiente ya que podría romperse el tubo si se cambia bruscamente la temperatura.00 3 . Se pusieron a calentar los tubos durante 10 minutos a baño maría. 6.07 3 8 0. se tomo 1 ml del tubo que contiene la enzima pura y se agrego a cada uno de los tubos que contienen solución de DNS.-Se le agrego a cada tubo 8ml de agua destilada y se agito. RESULTADO: TUBO DESAPARICIÓ N DE AMILASA 0 1 0 0.

al tubo seis 0.1ml 0.1% Agua Destilada Reactivo DNS 1 0ml 1ml 1ml 2 0.4ml de glucosa. al tubo cuatro 0.8ml de glucosa y al tubo siete 1ml de glucosa.8ml.243 5 0.-Se le agrego a cada tubo 8ml de agua destilada y se agito. en el tubo uno se le agrego 1ml. en el tubo dos 0.4ml 1ml 6 0.1ml de glucosa.8ml 1ml 4 0.1%. 3.Y por ultimo.-Al primer tubo (tiempo O) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos. 5. en el tubo uno se adiciona 0ml de glucosa. la glucosa es al 0.6ml 0.6ml 1ml 5 0. 9.2ml 0. en el tubo 2 se le agrega 0. de igual manera de menor a mayor.018 2 0. 6.2ml 1ml 7 1ml 0ml 1ml 1.-Correlacione los datos obtenidos con el cambio de color con las graficas de desaparición de glucosa. 4.9ml. al tubo cuatro 0.160 4 0. el tubo seis 0.-A continuación se graficaron los datos.-En un recipiente de precipitación se puso agua del grifo. RESULTADO: TUBO 0 CURVA 0 PATRO N DE GLUCO SA 1 0.4ml.088 3 0. 7.6ml. al tubo cinco 0. Se pusieron a calentar los tubos durante 10 minutos a baño maría. al tubo cinco 0. METODO PARA ELABORAR LA CURVA DE CALIBRACIÓN CON GLUCOSA QUE SERVIRA COMÓ PATRÓN PARA HACER EL ANÁLISIS DE REGRESIÓN LINEAL.4ml 0. calibrando la densidad óptica con el tubo blanco. absorvancia contra tiempo de reacción. a calentar hasta hervir (que salgan burbujitas) y con los tubos se unieron con ligas para evitar que se fueran de lado y se cayeran.2ml de glucosa.-Se tomo lectura en el espectrofotómetro a una absorvancia de 575nm cada uno. incluyendo al tubo para calibrar ya que se sedimenta.380 .2ml y en el tubo siete 0ml. se le agrega 1ml de solución de DNS.8ml 0.6ml de glucosa.324 6 0. de menor a mayor. INCLUYENDO EL COEFICIENTE DE COORELACIÓN (r) Solución Glucosa 0. 8. el tubo tres 0. al tubo tres 0.-Se agrego agua destilada. 2.9ml 1ml 3 0.-Se dejaron enfriar los tubos a temperatura ambiente ya que podría romperse el tubo si se cambia bruscamente la temperatura.-Se prepararon 7 tubos de ensaye (13 x 150mm) agregando a cada uno.

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ANEXOS: .

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un aumento en la concentración de la enzima aumenta la velocidad enzimática hacia cierto límite. y es una aldosa.. hasta ciertos límites.. sean activadores o coenzimas para funcionar adecuadamente. raíz y tallo). 5.CUESTIONARIO: 1. tiene dos tipos de polímeros de glucosa los que constituyen el almidón ya que se trata de una mezcla de dos compuestos: •la amilosa (30 %) es una molécula lineal de glucosa con elaces glucosidicos (1-4) sin ramificar.¿Por qué aparece la enzima en el germinado de maíz? La actividad enzimática. a una concentración fija de la enzima se obtiene la velocidad máxima. la concentración del cofactor debe ser igual o mayor que la concentración de la enzima para obtener una actividad catalítica máxima. la enzima pierde su actividad. es decir.. y cuál relación hay entre ellas? la glucosa es una hexosa.¿Qué diferencia bioquímica existe entre glucosa y almidón.. es necesaria para la síntesis de glucosa para que pueda obtener energía la misma semilla apartir de sus reservas energéticas. esto es..¿A qué grupo pertenece la enzima amilasa vegetal? De tipo exohidrolasa especifica 2. mientras que la fosforilasa va quitando de uno en uno la glucosa de las cadenas. 4.¿Cuáles son las condiciones que alteran las funciones de las enzimas? Concentración del sustrato... El calor es un factor que desnaturaliza las proteínas por lo tanto si la temperatura se eleva demasiada.A mayor concentración del sustrato. Concentración de la enzima. El almidón es un polímero hecho de glucosa que se utiliza como sustancia de reserva en las plantas. .Muchas enzimas dependen de los cofactores..Un incremento de 10°C duplica la velocidad de reacción.Siempre y cuando haya sustrato disponible. el grupo carbonilo está en el extremo de la molécula. pH.¿Cómo se distingue bioquímicamente la degradación del almidón por amilasa y por Fosforilasa? Por amilasa lo que hace con el almidon es romperlo en azucares mas simples. •la amilopectina (70 %) también adopta una posición helicoidal similar a la amilosa pero posee ramificaciones laterales originadas mediante enlaces a (1-6) cada 12 moléculas de glucosa. Para las enzimas que tienen cofactores. Temperatura. usando estas reservas mientras desarrolla sus órganos (hoja.. que contiene 6 átomos de carbono. un aumento en la concentración del sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reacción. Presencia de cofactores..El pH óptimo de la actividad enzimática optima es de 7 una variación de este pH varia la velocidad de reacción o la desnaturalización de la enzima. Después de que se alcanza esta velocidad. 3.

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