MATERIALES Y MTODOS

ELISA indirecto
El ELISA se realiz de acuerdo a los lineamientos descritos por (ReynaBelloa, Garca, & Manuel Rivera, 1998), se utilizaron placas de poliestireno
de 96 pocillos cada una con fondo plano. Para lograr las condiciones ptimas
del ensayo, se realizaron diluciones del suero 1, anticuerpo IgG bovina, y suero
2, suero de conejo anti E. coli, (1/50, 1/100, 1/200, 1/400) y del conjugado
(1/8000, 1/16000, 1/32000, 1/64000), el conjugado fue anticuerpo anti-IgG
bovino, obtenido en caprinos, acoplado a la enzima peroxidasa.
La placa de ELISA fue sensibilizada con el antgeno (100 L/pozo) diluido en
0.05M de tampn carbonato-bicarbonato pH 9.6 durante 18h a 4C en
cmara hmeda, como antgeno se utiliz un aislado de Trypanosoma
evansi obtenido de un caballo con infeccin natural, proveniente de una
regin endmica del llano venezolano (Uzcanga et al., 2004; Perrone et al.,
2009). Los parsitos purificados fueron lavados en tres ocasiones
consecutivas mediante centrifugacin a 1200g durante 10 min, empleando
un de bfer salino fosfato fro (PBS) 0,02 M, pH 7,2, conteniendo 1% de
glucosa. Finalmente, los parsitos se resuspendieron en 2 mL de agua
destilada y se sometieron a shock trmico (congelacin en nitrgeno lquido
y descongelacin en estufa) en cinco ocasiones consecutivas. El
homogenizado obtenido se centrifug a 7000 g por 15 min a 4C,
procediendo a retirar el sobrenadante, el cual fue usado como antgeno en
el ELISA. Una vez que las placas se sensibilizaron con el antgeno de T.
evansi, se efectuaron cinco lavados de 5 min cada uno empleando 200 L
de solucin de lavado en cada pozo (0,15 M de NaCl, con 0,1% de Tween
20). Los mismos cinco procedimientos de lavado antes descritos fueron
empleados despus de cada incubacin que sigui a cada uno de los
procesos del ELISA: bloqueo, aplicacin de suero y aplicacin del conjugado.
Para el bloqueo, se emple una solucin de leche descremada al 5% en 0,02
M PBS, pH 7,2 (200 L/pozo), aplicada durante aproximadamente 1 h a 37C
en cmara hmeda.
Para evidenciar la presencia de anticuerpos primarios, cada muestra del
suero 1 y suero 2 se diluy en tampn PBS-Tween (0,02 M, pH 7,2,
conteniendo 0,1% de Tween 20) y una alcuota (100 L) de cada una de las
diluciones del suero se aadi a cada pozo de la placa como se muestra en
la figura .
A
B
C
D
E
F
G

1
1:50
1:10
0
1:20
0
1:40
0
1:50
1:10
0
1:20

2
1:50
1:10
0
1:20
0
1:40
0
1:50
1:10
0
1:20

3
1:50
1:10
0
1:20
0
1:40
0
1:50
1:10
0
1:20

4
1:50
1:10
0
1:20
0
1:40
0
1:50
1:10
0
1:20

10

11

12

0
1:40
0

0
1:40
0

0
1:40
0

0
1:40
0

Figura . En la fila A se coloc 100 L del suero 1 (azul) con una dilucin de 1:50, en
la fila B se coloc 100 L del suero 1 (azul) con una dilucin de 1:100, en la fila C se
coloc 100 L del suero 1 (azul) con una dilucin de 1:200 y en la fila D se coloc
100 L del suero 1 (azul) con una dilucin de 1:400. Se realiz el mismo proceso con
el suero 2 (verde) empezando con la fila E hasta la fila H.

La placa con el respectivo suero fue incubada por 1 h a 37C en cmara

hmeda y posteriormente sometida a cinco lavados de la forma ya descrita.
Se procedi a diluir el conjugado en tampn PBS-Tween y a aplicar una
alcuota de 100 L en cada pozo como se muestra en la figura .
A
B
C
D
E
F
G
H

1
1:80
00
1:80
00
1:80
00
1:80
00
1:80
00
1:80
00
1:80
00
1:80
00

2
1:160
00
1:160
00
1:160
00
1:160
00
1:160
00
1:160
00
1:160
00
1:160
00

3
1:320
00
1:320
00
1:320
00
1:320
00
1:320
00
1:320
00
1:320
00
1:320
00

4
1:640
00
1:640
00
1:640
00
1:640
00
1:640
00
1:640
00
1:640
00
1:640
00

10

11

12

Figura . En la columna 1 se coloc la dilucin del conjugado 1:8000, en la columna

2 se coloc la dilucin del conjugado 1:1600, en la columna 1 se coloc la dilucin
del conjugado 1:3200

La placa se incub y lav nuevamente como se describi anteriormente,

para finalmente adicionar 100 L de la solucin de sustrato (H 2O2 0,5% +
ABTS: 2,2azino-bis-3-cido etilbenzotiazolina-6- sulfnico al 2%, en 0,05 M
de tampn citrato, pH 4,0).
Se controlaron 4 controles tanto positivos como negativos como muestra la
figura :
1.
2.
3.
4.

Suero + Conjugado + Sustrato (Positivo)

Antgeno + Conjugado + Sustrato (Negativo)
Conjugado + Sustrato (Negativo)
Sustrato (Negativo)
1

A
B
C
D
E

10

11

12

F
G
H
Figura . Amarillo: control 1, Naranja: control 2, Verde: control 3, Azul: control 4

Posteriormente se realiz la lectura de la densidad ptica (DO) en un lector

de ELISA a 405 nm.
Test flujo lateral cualitativo
Se realiz la prueba TORCH One Step Kit Serum/Plasma, de marca QikTech,
la cual est diseada para la deteccin de: IgG/IgM anticuerpos de
Toxoplasma gondii(TOXO), Cytomegalovirus (CMV), Rubeola, Virus de Herpes
Simplex (HSV-1 y HSV-2),
Antes de realizar la prueba se observ que tanto el kit y la muestra del
ensayo estn a temperatura ambiente, luego se coloc la tarjeta de prueba
en un lugar seco y una superficie de trabajo plana y horizontal, se aadi
10l de suero en cada pocillo de muestra, luego 100 l de PBS para diluir el
suero, se dej reposar la tarjeta y se observ el resultado despus de 15
minutos, se debe tener en cuenta que pasado los 20 minutos, el resultado
no es vlido.
Este test consta de dos regiones: regin control C y regin prueba T,
para determinar si el resultado de esta prueba es positivo se debe obtener
dos bandas color rosa que marquen las regiones C y T, si la banda marca
solo la regin C el resultado es negativo, para almacenar el kit la
temperatura puede estar entre 4C y 30 C, no es necesario almacenar en
refrigeracin, pero si utilizar el kit antes de la fecha de vencimiento.
DISCUSIN
ELISA indirecto
La lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como
colorimtricamente. A simple vista, pueden ser ledos ciertos ensayos
rutinarios en los que no haga falta una cuantificacin y no se presenten
abundantes casos dudosos ya que dicha lectura visual tendr el
inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los
casos lmite. No obstante, evita la adquisicin de aparatos relativamente
costosos como son los lectores de microplacas (Casper, 2011).
Una de las grandes ventajas de la tcnica ELISA es la posible
automatizacin de la lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha
automatizacin se puede conseguir con un simple colormetro o
espectrofotmetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura
automtica de microplacas (Casper, 2011).
La enzima escogida como marcador debe unirse fcilmente a antgenos y
anticuerpos, encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un
substrato cromognico o fluorognico conveniente y de fcil preparacin.
Las enzimas ms utilizadas son fosfatas alcalina, peroxidasa de rbano y galactosidasa (Del Bono et al., 1989).

La eleccin del substrato es de gran importancia para la estandarizacin del

mtodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta, como son
sensibilidad, especificidad, repetibilidad, facilidad de lectura y complejidad
de preparacin, as como estabilidad despus de la parada de la reaccin
(Del Bono et al., 1989).
Test flujo lateral cualitativo
Los valores de IgG mayores de 200 UI/mL, sugieren infeccin actual por
Toxoplasma gondii. Los valores de IgM mayores de 22 UI/mL indican que
existe una infeccin actual por cytomegalovirus. Valores de IgM mayores de
25 UI/mL son un indicativo de infeccin actual por rubeola (UPC, 2014).
La prevencin de la primoinfeccin por toxoplasma durante el embarazo es
el mejor modo de evitar una infeccin congnita. A las madres
seronegativas se les recomienda adoptar una serie de medidas preventivas,
tales como no ingerir carne cruda o poco cocida, evitar el contacto con los
gatos y sus excrementos y lavarse las manos despus del contacto con
objetos o comida potencialmente contaminada como frutas, verduras y
carne (Muoz, 2003).
Los agentes recomendados contra Toxoplasma gondii actan sobre todo
contra la forma de taquizoitos y por lo tanto, no erradican la forma
enquistada. La Pirimetamina es considerada el agente anti-toxoplasma ms
eficaz, y, si fuera factible, siempre debe ser incluida en los regmenes
farmacolgicos. Se debe administrar cido flico simultneamente para
evitar la supresin medular. Hay que agregar un segundo frmaco como la
sulfadiazina o clindamicina (Gomez, 2007).
7. Qu significa para ELISA?
Ciertas enfermedades necesitan de una prueba de diagnstico fiable y
rpida y que se pueda llevar a cabo en cualquier laboratorio ya que
ayudara a obtener un diagnstico precoz definitivo de la enfermedad, por lo
que la tcnica de ELISA permitira realizar este diagnstico, sin embargo
existen tcnicas serolgicas ms rpidas que se podran utilizar (Kashyap, y
otros, 2006).
8. Cules son las enzimas utilizadas en este inmunoensayo?
Se realiz la adicin de los anti-anticuerpos conjugados con una enzima, en
el caso de nuestro inmunoensayo fue la enzima peroxidasa. El ABTS es el
sustrato de la enzima peroxidasa y se obtiene un producto de reaccin final
verde soluble en agua. El producto verde tiene dos principales picos de
absorcin, 410 nm y 650 nm. El desarrollo del color es lento
(aproximadamente 20 minutos) (Casper, 2011).
9. Por qu necesita para ensayar muestras de control positivas y
negativas, as como sus muestras experimentales?
El control positivo de la prueba de ELISA fue una muestra soluble que se
sabe que contena la protena que se estaba detectando (anticuerpo IgG
bovino). Un resultado positivo en el control positivo, incluso si las muestras
son negativas, indicar que el procedimiento es ptimo y est funcionando.
El control negativo fue una muestra conocida, que no expresa la protena se

est detectando. Esto es para comprobar si hay resultados positivos falsos y

de unin no especficos. Cada placa que se utiliza debe contener una
muestra de control negativo con el fin de validar los resultados (Casper,
2011).
10. Qu pas con las protenas en el plstico bien si la muestra
contiene el antgeno? Y si no contiene el antgeno?
Durante el ensayo se aaden las muestras de suero a los antgenos que se
encuentran cubiertos en la placa y luego se incuba. Si la muestra contiene
anticuerpos IgG bovino, se unirn a los antgenos que se encuentran en la
placa para formar el complejo antgeno-anticuerpo inmovilizados. Si las
muestras no contienen el anticuerpos no se formarn los complejos (Casper,
2011).
11. Por qu se necesita para lavar los pozos despus de cada
paso?
Muchos procedimientos de inmunoensayo incluyen una serie de
incubaciones con diferentes reactivos inmunoqumicos separadas por pasos
de lavado. Las etapas de lavado son necesarias para eliminar los reactivos
no unidos y reducir el fondo, aumentando as la relacin seal: ruido. Un
lavado insuficiente permitir alto fondo, mientras que el lavado excesivo
puede dar lugar a disminucin de la sensibilidad causada por la elucin del
anticuerpo y / o antgeno del pozo. Una variedad de tampones puede ser
utilizados (Casper, 2011).
12. Cuando se aadi el anticuerpo primario a los pozos, lo que
sucedi si su muestra contena el antgeno? Y si no contiene el
antgeno?
Se aade el anticuerpo primario y se ligar si hay un eptopo del antgeno
en el pocillo. Si el pocillo no contiene el antgeno no se formarn los
complejos anticuerpo antgeno y ser eliminado por medio del lavado
(Berg et al., 2007).
13. Cuando se aadi el anticuerpo secundario a los pocillos, que
sucedi si su muestra contena el antgeno? Y si no contiene el
antgeno?
El segundo anticuerpo de aade despus del lavado en la fase de adicin
del primer anticuerpo, estos segundos anticuerpos estn conjugados
covalentemente con una enzima, los cuales reaccionarn con los
anticuerpos aadidos anteriormente, si en el pocillo no existe la presencia
de los antgenos buscados el conjugado permanecer libre en su totalidad y
ser eliminado por medio de otro lavado (Berg et al., 2007).
14. Si la muestra dio un resultado negativo para el agente causante
de la enfermedad, significa esto que no tiene la enfermedad? Qu
razones puede haber para que un resultado negativo cuando en
realidad tienen la enfermedad?
En el ELISA indirecto se detecta la presenia de anticuerpos (Berg et al.,
2007). La reaccin positiva se observa cuando existe un cambio de color de
amarillento palido a un color ms oscuro, en cambio en las muestras que

resultan negativas no se observa el cambio de color y es porque tienen el

anticuerpo frente a Toxoplasma gondii, pero se debe tomar en cuenta que la
tonalidad depende tambin de la concentracion de antgeno por lo que
mediante espectrofotometra se puede cuantificar la cantidad de anticuerpo
presente en cada dilucin (Guerina et al., 1994).
La purificacin parcial de antgenos provoca que disminuya la sensibilidad y
especificidad de la tcnica y lo haga menos eficaz (Montenegro-James et al.,
1985), dando una serie de reacciones falsos positivos y falsos negativas,
provocadas en algunos casos por la baja sensibilidad del mtodo (McGuire
et al., 1979).
La frecuencia de falsos negativos es menor que la de falsos positivos,
debido a que no se realizan exmenes de comprobacin para los falsos
negativos, muchas veces una carga viral o bacteriana indetectable da como
resultado negativo pero eso no quiere decir que no padezca de la
enfermedad e incluso es capaz de transmitir dicha enfermedad, tambin
estos falsos positivos se encuentran relacionados con fallos en el principio
tcnico, malas tomas de muestra, someter al suero de muestra a
temperaturas elevadas, inespecificidad en la unin antgeno anticuerpo y
falta de experiencia en las personas encargadas de la prueba (Zaaijer et al.,
1998).
15. Qu pruebas a base de anticuerpos se puede comprar en su
farmacia local?
Los anticuerpos son protenas del sistema inmunitario. El organismo los
fabrica como parte de su defensa contra la infeccin, ya que ayudan a
destruir molculas extraas. Los anticuerpos que son especficos contra
algun virus por ejemplo hepatitis C slo se sintetizan cuando el virus est
presente en el organismo. Por tanto, si estos anticuerpos se identifican en la
sangre, implica que la persona ha estado en contacto con el virus en algn
momento. Sin embargo, la presencia de estos anticuerpos no significa
necesariamente que siga teniendo el virus en la sangre, pero s que en un
momento dado estuvo (ASSCAT, 2014).
16. Si usted tiene positivo por exposicin a la enfermedad, Si no,
qu conclusiones puede alcanzar acerca de transmisibilidad de la
enfermedad en una poblacin animal?
En el pasado, las enfermedades transmisibles constituan la principal causa
de muerte en el mundo. Algunos efectos de la industrializacin, tales como
el mejoramiento de la nutricin, vivienda, sanidad, agua potable y drenaje,
as como el desarrollo de antibiticos y vacunas y el establecimiento de
sistemas de vigilancia epidemiolgica permitieron el control relativo de tales
enfermedades (Gutirrez, 2006).
Una enfermedad transmisible es cualquier enfermedad causada por un
agente infeccioso y/o parasitario especfico; o por sus productos txicos, se
manifiesta por la transmisin de ese agente o sus productos, de una
persona o animal infectado, o de un reservorio a un husped susceptible.
Puede transmitirse en forma directa, o indirecta por medio de un husped

intermediario de naturaleza vegetal

determinada (Gutirrez, 2006).

animal,

de

rea

geogrfica

Un reservorio es cualquier ser humano, animal, artrpodo, suelo, materia, o

una combinacin de ellos, en el cual normalmente vive y se multiplica un
agente infeccioso de manera que pueda ser transmitido a un husped
susceptible (Gutirrez, 2006).
En las poblaciones animales los recin nacidos y crias jvenes son ms
susceptibles que los de mayor edad a enfermedades propagadas por
contacto directo (Chin, 2001).
Incrementar la distancia entre animales reducir el contacto directo entre
los que estn sanos y aquellos que pudieran ser portadores de
enfermedades (China, 2001).
Las enfermedades transmisibles pueden reemerger debido al desarrollo de
resistencia de los agentes infecciosos existentes a los antibiticos
convencionales y a los de nueva generacin, tambin pueden reemerger por
aumento de la susceptibilidad del husped inmunodeprimido, por factores
tales como la desnutricin o la presencia de otras enfermedades, que
disminuyen su resistencia a agentes infecciosos. Otra causa puede ser el
debilitamiento de las medidas de salud pblica adoptadas para infecciones
previamente controladas (Reingold, 2000).
17. Por qu necesitamos controles?
El empleo de muestras control aseguren que el mtodo est funcionando
adecuadamente y confirme la calidad de los datos (Jacobson, 1998).
Teniendo en cuenta la incertidumbre en torno a la seguridad y fiabilidad de
tecnicas en el diagnstico, se deben tomar precauciones especiales en
cualquier laboratorio para la deteccin de agentes infecciosos, con el fin de
evitar resultados positivos falsos o negativos falsos. Estos, junto con los
controles garantizan la evaluacin segura de los resultados, excluyendo los
resultados positivos falsos causados por la contaminacin (Jacobson, 1998).
La presencia de los controles es necesaria no slo en los experimentos
cualitativos sino tambin en los cuantitativos, entendemos por cualitativos
cuando esperamos una respuesta de todo o nada sin importar la cantidad,
dicho en otros trminos, la respuesta es negativa o positiva. En cambio, en
un experimento cuantitativo queremos medir la cantidad de los que
estamos buscando en una muestra (Jacobson, 1998).

BIBLIOGRAFA

ASSCAT. (2014). Diagnstico de la hepatitis c: cmo saber si se

padece la enfermedad. Pruebas de hepatitis c. Cribado.
Berg et al., (2008). Bioquimica. Sexta edicin, Editorial REVERT.
Barcelona-Espaa.
Casper, M. N. (2011). Thermo Fisher Scientific Inc. Obtenido de
https://www.thermofisher.com/ec/en/home/life-science/protein-

biology/protein-assays-analysis/elisa/elisa-enzyme-substratesselection-guide.html
Chin James. (2001) El control de las enfermedades transmisibles.
Dcimo sptima edicin. Organizacin Panamericana de la Salud.
Del Bono, V., A. Canessa, P. Bruzzi, M. A. Fiorelli, and A. Terragna.
(1989). Significance of specific immunoglobulin M in the chronological
diagnosis of 38 cases of toxoplasmic lymphadenopathy. J Clin
Microbiol
Gomez, A. (2007). TOXOPLASMOSIS: SUS FORMAS CLINICAS. Revista
de Posgrado de la VIa Ctedra de Medicina, 164, 15-19.
Guerina, N. G., H. W. Hsu, H. C. Meissner, J. H. Maguire, R. Lynfield, B.
Stechenberg, I. Abroms, M. S. Pasternack, R. Hoff, R. B. Eaton. (1994).
Neonatal serologic screening and early treatment for congenital
Toxoplasma gondii infection. The New England Regional Toxoplasma
Working Group. N Engl J Med 330: 1858-63.
Gutirrez, S., Magaly, P. (2006) Manual de Prevencin de
Enfermedades Infecciosas y Parasitarias. Segunda impresin.
Vicerrectorado Acadmico. Universidad Central de Venezuela.
IGSS. (2013). Manejo de TORCH en el embarazo . Recuperado el 20 de
Febrero de 2016, de Instituto Guatemalteco de Seguridad Social:
http://www.igssgt.org/images/gpc-be/ginecoobstetricia/GPC-BE
%2045%20TORCH.pdf
Jacobson R.H. (1998). Validacin de pruebas serolgicas para el
diagnstico de enfermedades infecciosas. Laboratorios veterinarios
para las enfermedades infecciosas.
Kashyap, R. S., Rajan, A. N., Ramteke, S. S., Agrawal, V. S., Kelkar, S.
S., Purohit, H. J., . . . Daginawala, H. F. (2006). Diagnosis of
tuberculosis in an Indian population by an indirect ELISA protocol
based on detection of Antigen 85 complex: a prospective cohort
study. BioMed Centra, 7.
McGuire, T., Musoke, A., & Kurtti, T. 1979. Functional properties of
bovine IgG1 and IgG2: interaction with complement macrophages,
neutrophils and skin. Immunol. 38: 249-256.
Montenegro-James, S., James, M. & Ristic, M. (1985). Efficacy of
purified Anaplasma marginale initial bodies as a vaccine against
anaplasmosis. Parasitol. Res. 77: 93-101.
Muoz, C. (2003). INFECCIN POR TOXOPLASMA: TRANSMISIN,
DIAGNSTICO, PROFILAXIS Y TRATAMIENTO . Ed Cont Lab Cln , 7, 712.
Reingold AL. (2000). Infectious disease epidemiology in the 21st
Century: Will it be eradicated or will it reemerge? Epidemiological
Reviews.
Reyna-Belloa, A., Garca, F. A., & Manuel Rivera, B. S. (1998). Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antiTrypanosoma evansi equine antibodies. Veterinary Parasitology, 2-4.
Sanbonmatsu. (2014). Infeccin por citomegalovirus humano. Enferm
Infecc Microbiol Clin, 32(1), 15-22.
UPC. (2014). ANTICUERPOS Anti-CITOMEGALOVIRUS IgG e IgM.
Recuperado
el
20
de
Agosto
de
2016,
de
www.upc.com.mx/examenes/v/60

UPC. (2014). ANTICUERPOS Anti-RUBEOLA IgG e IgM EN SANGRE.

Recuperado
el
20
de
Agosto
de
2016,
de
http://www.upc.com.mx/examenes/v/118
UPC. (2014). ANTICUERPOS Anti-Toxoplasma gondii IgG e IgM EN
SANGRE.
Recuperado
el
20
de
Agosto
de
2016,
de
http://www.upc.com.mx/examenes/v/130.
Zaaijer et al. (1998). Validation of a new immunoblot assay (LiaTek
HIV III) for confirmation of Human Immunodeficiency Virus infection.