ANALISIS DE IVERMECTINA POR EL METODO DE ELISA

FUNDAMENTO El ELISA se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro.

EQUIPOS Y MATERIALES

Analizador de ELISA Lavador de ELISA Dispensador de lquidos (pueden usarse pipetas multicanal). Incubadora especializada para las placas. Vortex Centrifuga Extractor de flujo Bloque de calentamiento. Kits de elisa Acetonitrilo NACl 0.5 M Metanol 100% Acetato de etilo. Agua destilada PROCEDIMIENTO Preparacin de la muestra Para la preparacin de la muestra, se homogeniza la muestra, se transfiere 1 gramos de la misma en un tubo de ensayo, se le adiciona 1 ml 0,5 M de NaCl, adicionar 1 ml de metanol al 100%. Se agita durante un minuto, se le adiciona 5 ml de acetato de etilo y mezclar durante 10 minutos; despus se centrifuga la muestra (5 minutos a 2000 xg), se

toman 4 ml de la capa superior y es pipeteada a un tubo de vidrio y se procede a evaporar el acetato de etilo residual de la muestra a 50C. Se re disuelve el residuo en 100 de acetonitrilo, se agita en un vortex y se centrifuga de nuevo durante 5 minutos a 2000 xg. Se diluye 10 del sobrenadante con 190 del buffer de dilucin y se agita nuevamente. Se toma 50 para utilizar en la prueba Elisa. Toma de muestras En lvermectina, se realizara un muestreo del 100% del lote ganadero inicialmente (reses individuales); es decir si hay 10 lotes ganaderos se muestrear el 5% de cada lote. En caso de obtener resultados positivos se intensificara el muestreo al 10% del lote ganadero. Se tomaran muestras de musculo, la parte de la paleta de la res (rea de inyeccin) con un peso de 200 g. Procedimiento de anlisis. Pipetee 100 (blanco) del cero standard en duplicado en las posiciones A1 y A2

Pipetee 50 del cero standard por duplicado en la posiciones B1 y B2 (cero standard) Pipetee 50 de cada una de las soluciones standard en duplicado (pozos C1-C2 al H1-H2) Pipetee 50 plato. de cada muestra por duplicado en los pozos restantes del

Adicionar 25 de la solucin conjugada (Ivermectina HRP) dentro de lo pozos, excepto en los pozos A1 y A2. Adicionar 25 de la solucin de anticuerpos dentro de los pozos, excepto en los pozos A1 y A2. Sellar el plato y agitar durante 1 minuto. Incubar por una hora en la oscuridad a 37C.

Descartar la solucin del plato y lavar durante 3 veces con el buffer de lavado. Pipetear 100 de la solucin sustrato dentro de cada pozo.

Incubar durante 30 minutos a una temperatura de 20. 25 C. Adicionar 100 de la solucin de parada en cada pozo.

Leer la absorbancia inmediatamente a 450 nm

Observaciones La prueba Elisa es una tcnica muy delicada, por lo que se debe tener mucha concentracin al momento de realizar el ensayo para que los resultados tengan la mayor confiabilidad al ser ledos, esto con el objetivo de que se garantice la seguridad de nuestras exportaciones.

Resultados La lectura de los resultados puede ser valorada colorimtricamente. Los resultados finales de la lectura colorimtrica se reflejan numricamente mediante valores de absorbancia o densidad ptica que se obtendrn a la longitud de onda ms adecuada para la coloracin final alcanzada. Calcular la concentracin de Ivermectina en cada muestra de acuerdo a la curva de calibracin establecida con el software Gen 5.0.