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istherightofallhumanstoknowandspeakthelawsthatgovernthem.
istherightofallhumanstoknowandspeakthelawsthatgovernthem. NTE INEN 1529-13 (1998) (Spanish): Control microbiológico

NTE INEN 1529-13 (1998) (Spanish): Control microbiológico de los alimentos. Enterobacteriaceae. Recuento en placa por siembra en profundidad

(Spanish): Control microbiológico de los alimentos. Enterobacteriaceae. Recuento en placa por siembra en profundidad
(Spanish): Control microbiológico de los alimentos. Enterobacteriaceae. Recuento en placa por siembra en profundidad
(Spanish): Control microbiológico de los alimentos. Enterobacteriaceae. Recuento en placa por siembra en profundidad
INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN Quito - Ecuador NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 1 52 9-13:98

INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN

Quito - Ecuador

NORMA TÉCNICA ECUATORIANA

NTE INEN 1 52 9-13:98

CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS. ENTEROBACTERIACEAE. RECUENTO EN PLACA POR SIEMPBRA EN PROFUNDIDAD.

Primera Edición

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First Edition

Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN – Casilla 17-01-3999 – Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción

CDU:

ICS: 07.100.30

614.31:579.67:579.84

la reproducción CDU: ICS: 07.100.30 614.31:579.67:579.84 CIIU: 9320 AL 01.05-310 Norma Técnica CONTROL

CIIU: 9320

AL 01.05-310

Norma Técnica

CONTROL MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS. ENTEROBACTERIACEAE. RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN PROFUNDIDAD

NTE INEN

 

Ecuatoriana

1 529-11:98

Opcional

1998-01

 

1. OBJETO

 

1.1 Esta norma describe el método de recuento en placa por siembra en profundidad para determinar el número de células viables de Enterobacteriaceae presentes en un gramo o centímetro cúbico de muestra.

 

2.

ALCANCE

 

2.1

Este método es indicado para productos que contengan una alta carga de Enterobacteriaceae.

 

3. DEFINICIONES

 
 

3.1

Enterobacteriaceae. Familia de microorganismos, cuyos miembros son bacilos Gram negativos

móviles por flagelos peritricos o inmóviles, capsulados o no, no esporulados, aerobios y anaerobios facultativos; fermentan la glucosa generalmente con producción de gas, reducen los nitratos a nitritos; son catalasa positivos, excepto un serotipo de shiguela; son oxidasa negativos, comensales, saprofitos, o patógenos intestinales.

3.2 Recuento de Enterobacteriaceae. Es la determinación del número de colonias típicas de Enterobacteriaceae que se desarrollan a partir de un gramo ó cm 3 de muestra, utilizando medios selectivos.

 

4.

RESUMEN

 

4.1

Este método se basa en la capacidad de las Enterobacteriaceae, de producir ácidos a partir de

la glucosa, y utiliza la técnica del recuento en placa por siembra en profundidad, en agar cristal violeta-rojo neutro-bilis-glucosa (VRBG) o similar, y una temperatura de incubación de 37 ± 1 ° C.

 

5. MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

 
 

5.1

Materiales. La vidriería debe resistir esterilizaciones repetidas y todo el material debe estar

perfectamente limpio y estéril.

 

5.1.1

Pipetas serológicas de punta ancha de 1, 5 y 10 cm 3 graduadas en 1/10 de unidad.

5.1.3

Incubador regulable, rango de temperatura de 25 a 70 ± 1 ° C.

 

5.1.4

Autoclave

 
 

(Continúa)

 

DESCRIPTORES: Productos alimenticios, análisis microbiológico, contaje, enterobacteriaceae

 

NTE INEN 1 529-13

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5.1.5 Balanza de capacidad no inferior a 2.500 g y de 0,1 g de sensibilidad.

5.1.6 Contador de colonias

5.1.7 Frascos de boca ancha de 250, 500 y 1000 cm 3 con tapas de rosca autoclavables.

5.1.8 pH-metro

5.1.9 Erlenmeyer de 500 y 1000 cm 3

5.1.10 Papel Whatman No. 2 en cuadrados o tiras pequeñas.

5.2 Medios de cultivo y reactivos: ver NTE INEN 1529-1. Preparación de medios de cultivo.

5.2.1 Caldo triptona soya (CTS).

5.2.2 Medio glucosa sal

5.2.3 Agar nutritivo

5.2.4 Agar cristal vileta-rojo neutro-bilis-glucosa (VRBG).

5.2.5 Solución acuosa al 1 % de dihidrocloruro de tetrametil - parafenilen - diamina.

5.2.6 Vaselina líquida estéril.

6. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

6.1 Preparar la muestra según uno de los procedimientos indicados en la NTE INEN 1 529-2. Toma y preparación

de muestras.

7. PROCEDIMIENTO

7.1 Revitalización de las Enterobacteriaceae. Agitando de vez en cuando, mantener los tubos de las

diluciones decimales a temperatura del laboratorio (20 a 25 ° C), por dos horas. Esta etapa aplicar a alimentos que han sufrido tratamientos de conservación (químicos o físicos).

7.1.1 Realizar las diluciones en caldo soya triptona a partir de la suspensión madre (10 -1 ); utilizar una nueva

pipeta estéril para cada dilución.

7.2 Siembra. Utilizando una pipeta estéril, de cada una de las diluciones decimales pipetear, por

duplicado, alícuotas de 1 cm 3 en placas Petri adecuadamente identificadas. Iniciar por la dilución de menor concentración.

7.2.1 Inmediatamente, verter en cada una de las placas inoculadas aproximadamente 20 cm 3 de agar

'VRBG" previamente fundido y templado a 45 ± 2 ° C.

(Continua)

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7.2.2 Delicadamente, mezclar el inóculo de siembra con el medio de cultivo, imprimiendo a la

placa movimientos de vaivén, 5 veces en una dirección; hacerla girar cinco veces en sentido de las agujas de reloj; repetir este proceso, pero en sentido contrario.

7.2.3 Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a 37 ° C por 16 a 18 horas.

7.3 Recuento de colonias

7.3.1 Lectura. Pasado el tiempo de incubación, si es posible, seleccionar las placas de dos diluciones

consecutivas que presenten entre 15 y 150 colonias características y examinar con luz transmitida. Contar todas las colonias púrpura, rodeadas generalmente de un precipitado también de color púrpura. Anotar el número de colonias y la respectiva dilución.

7.3.2 Si en la mitad o en más de la mitad de la superficie de las placas hay crecimiento

invasivo desechar la placa. Si menos de la mitad de la superficie está cubierta, contar las colonias en la parte clara y extrapolar de tal manera que el número corresponda a la superficie total de la placa.

7.3.3 Si las placas de todas las diluciones contienen más de 150 colonias, contar en las placas

inoculadas con la menor cantidad de muestra.

7.4 Selección de colonias. siempre que se requiere de ensayos confirmatorios, éstos deben ser realizados a partir de colonias previamente seleccionadas y purificadas.

7.4.1 Del total de colonias típicas, presuntas, seleccionar las bien aisladas, en un número equivalente a la raíz

cuadrada, con un mínimo de cinco.

7.4.2 A cada una de estas colonias inocularlas individualmente, en tubos que contengan agar nutritivo inclinado

o PCA. Incubar a 37 ° C por 24 ± 1 h.

7.4.3 Hacer extensiones de éstos subcultivos, comprobar su pureza (solo bacilos Gram negativos) y utilizarlos para realizar pruebas complementarias.

7.5 pruebas complementarias

7.5.1 Prueba de la oxidasa: sobre un vidrio o dentro de una placa Petri colocar un cuadrado o tira de papel

filtro, humedecerlo con unas gotas de la solución de dihidrocloruro de tetrametil para fenilendiamina. Cuidadosamente, sobre este papel frotar un asa del cultivo 7.4.3, haciendo una pequeña raya. Es positiva si aparece un color púrpura oscuro en 5 a 10 segundos. Las enterobacterias tienen reacción negativa.

7.5.2 Prueba de la utilización de la glucosa: en un tubo de medio glucosa sal, con aguja sembrar por

picadura el subcultivo en agar nutritivo (7.4.3); luego, cubrirlo con vaselina líquida estéril. Incubar a 37 C por 24 h. La reacción es positiva si el color del medio cambia a amarillo. Las enterobacterias tienen reacción positiva. La mayoría de las cepas producen gas.

°

7.5.3 Cuando se desea conocer otras propiedades de las cepas de enterobacterias aisladas se

debe realizar las respectivas pruebas bioquímicas.

(Continua)

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8. CALCULOS

8.1 Caso se realicen pruebas complementarias, calcular basándose en el número de colonias

confirmadas en relación al número total de las colonias típicas contadas (presuntas enterobacterias) y si por lo menos, el 80% de las colonias típicas sometidas a las pruebas complementarias son confirmadas como Enterobacteriaceae, tomar el número de colonias típicas contadas en 7.3 como el número de enterobacterias por placa.

8.2 Cálculo del número (N) de unidades formadoras de colonias (UFC) de Enterobacteriaceae por centímetro cúbico ó gramo de muestra. Utilizar la siguiente fórmula:

número total de colonias contadas o calculadas

N =

Cantidad total de muestra sembrada

C

N = V n

(

1

+ 0,1

n

2

)

d

En donde:

C = suma de las colonias de enterobacterias contadas o calculadas en todas las placas elegidas;

=

n 1

n 2

d =

V =

=

número de placas contadas de la primera dilución seleccionada;

número de placas contadas de la segunda dilución seleccionada;

dilución de la cual se obtuvieron los primeros recuentos, por ejemplo 10- 2 ;

volumen del inóculo sembrado en cada placa.

Ejemplo:

Volumen sembrado

=

Dilución 10 -2

=

Dilución 10 -3

=

Número

=

=

=

1 cm 3

160 y 140 colonias

33 y 28 colonias

160

+

140

+

33

+

28

1(2

+

0,1 x2)10

361

0,022

-2

16 409 expresar como 1,6 x 10 4

8.3 Redondeo de números. El valor obtenido redondear a dos cifras significativas, de la siguiente

manera (NTE INEN 52):

8.3.1 Si el tercer dígito, empezando por la izquierda es menos de cinco, mantener inalterado el segundo dígito y reemplazar por ceros los restantes. Por ejemplo, si el valor calculado fuere 16 409, redondearlo a 16 000 y expresar como 1,6 x 10 4 . Si el tercer dígito, empezando por la

izquierda es superior a cinco, añadir una unidad al segundo dígito. Por ejemplo, si el valor obtenido

fuere 16 900, redondearlo a 17 000 y expresar como 1,7 x 10

4

.

(Continúa)

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8.3.2 Si el tercer dígito empezando por la izquierda es igual a cinco y es seguido de por lo menos, un dígito,

añadir una unidad al segundo dígito y reemplazar por ceros los restantes. Por ejemplo, si el valor obtenido fue 16 540, redondearlo a 17 000 y expresar como 1,7 x 10 4 . Si el tercer dígito es igual a cinco y no le sigue otro (s) dígito (s), ó lo es solo por ceros, añadir una unidad al segundo dígito, si éste es impar; si es par ó cero, conservarlo inalterado. Ejemplo, 175 redondear a 180 y expresar como 1,8 x 10 2 ; 16 500 redondear a 16 000 y expresar como 1,6 x 10 .

4

8.4 Presentación de resultados

8.4.1 Presentar el resultado como número N de unidades formadoras de colonias UFC de

Enterobacteriaceae por cm 3 ó g de muestra utilizando solo dos cifras significativas multiplicadas por 10 x , donde x es la respectiva potencia de 10.

8.4.2 Si no hay desarrollo de colonias de enterobacterias en las placas de la dilución más

concentrada, presentar el resultado como número estimado (N E ) de UFC de Enterobacteriaceae menor que (<) 1,0 multiplicado por el respectivo factor de dilución “f”. (valor inverso de la dilución de la muestra). Ejemplo, si la dilución más concentrada corresponde a 10 -1 , el resultado se presentará así:

N E de UFC de Enterobacteriaceae/cm 3 ó g = < 1,0 x 1,0 1

8.4.3 Si no hay desarrollo de colonias de enterobacterias en las placas sembradas con 1 cm 3 de

muestra no diluida (producto original líquido), expresar el resultado de la siguiente manera:

N E de UFC de Enterobacteriaceae/cm 3 = < 1,0 x 1,0 0

8.4.4 Si las placas sembradas con la dilución menos concentrada (productos sólidos o líquidos)

presentan más de 150 colonias, expresar el resultado de la siguiente manera:

N E de UFC de Enterobacteriaceae/cm 3 ó g = >al valor obtenido x “f”

Indicar entre paréntesis la dilución utilizada. Este resultado sirve como guía para decidir el número de diluciones que se han de realizar en ensayos posteriores y, la decisión de aceptación o rechazo de una partida de alimentos debe basarse solo en valores N.

9. PRECISION DEL METODO

9.1 Repetibilidad del recuento de colonias y error personal.

9.1.1 Los resultados obtenidos por la misma persona al contar por segunda vez las colonias de una

misma placa, no deben variar en más del 5% y del 10% cuando es realizado por otra persona.

9.1.2 El método de cálculo relacionando el número total de colonias contadas en las placas de dos

diluciones consecutivas con el total de la muestra sembrada, aumenta la precisión del resultado. Sin embargo, solo por razones estadísticas, en el 95% de los casos los límites de confianza para la técnica del recuento en placa varía de ± 16% a ± 52%, este intervalo se amplía para los recuentos de colonias menores de 15 por placa. En la práctica, se puede encontrar una mayor variación, especialmente entre resultados obtenidos por diferentes analistas.

(Continua)

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10. INFORME DEL ENSAYO

10.1 En el Informe del ensayo Indicar la norma de referencia, la temperatura de incubación, los resultados obtenidos, todas las condiciones operativas no especificadas en esta norma o aquellas consideradas como opcionales y los incidentes que puedan haber influenciado en el resultado. Además, se debe Incluir toda la información necesaria para la completa Identificación de la muestra.

(Continua)

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APÉNDICE Z

Z.1 DOCUMENTOS NORMATIVOS A CONSULTAR

Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 52:73 Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1 529.1:94

Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1 529.2:94

Reglas para redondear números Control microbiológico de los alimentos. Preparación de medios de cultivo. Control microbiológico de los alimentos. Toma y preparación de muestras

Z.2 BASES DE ESTUDIO

Norma Británica BS 5763: Part 1: 1991 (ISO 4833: 1991) Methods for Microbiological Examination of Food and Animal Feeding Stuffs. Enumeration of microorganisms. Colony count technique at 30 ° C. British Standards Institution. London, 1991.

Norma Británica BS 5763: Part 10: 1986 (ISO 7402 - 1985). Microbiological Examination of Food and Animal Feeding stuffs. Enumeration of Enterobacteriaceae. British Standards Institution. London, 1986.

Norma Británica BS 4285: Section 2.1: 1984 Microbiological Examination for Dairy Purposes. Section 2.1 Enumeration of microorganisms by poured plate technique for colony count. British Standards Institution. London, 1984.

Norma Internacional ISO 5552: 1979. Meat and meat products. Detection and Enumeration of Enterobacteriaceae (Reference methods). International Organization for Standardization. Switzerland, 1979.

Mossel, D.A.A., Moreno García B. "Microbiología de los Alimentos',1ra. Edición Española. Acribia, Zaragoza - España, 1982.

Centro Nacional de Alimentación y Nutrición. "Métodos de Examen Microbiológico para Alimentos y Bebidas", Normas recomendadas. Manual Práctico, Madrid 1976.

Mossel D.A.A, Quevedo F. "Control Microbiológico de los Alimentos". Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.

ICMSF. "Microbiología de los Alimentos 1 - Técnicas del Análisis Microbiológico". Acribia Zaragoza - España.



INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA

Documento:

TITULO: CONTROL MICROBIOLOGICO DE LOS

Código:

NTE INEN 1529-13

ALIMENTOS. ENTEROBACTERIA CEAE. RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN PROFUNDIDAD

AL 01.05-310

ORIGINAL:

REVISIÓN:

Fecha de iniciación del estudio:1992-10-08

Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo Oficialización con el Carácter de

por Acuerdo No.

de

publicado en el Registro Oficial No.

de

Fecha de iniciación del estudio:

Fechas de consulta pública: de

a

Subcomité Técnico: Control microbiológico de los alimentos Fecha de iniciación: 1993-08-02 Integrantes del Subcomité Técnico:

Fecha de aprobación:1994-05-31

NOMBRES:

INSTITUCIÓN REPRESENTADA:

Dr. Ramiro Gallegos (Presidente) Dr. Hugo Ayala

SUBDIRECTOR TECNICO DIRECCION DE CERTIFICACION Y CONTROL

Ing. Enrique Troya

DE CALIDAD DIRECCION DE PROTECCION AL

Bioq. Elena Larrea

CONSUMIDOR DIRECCION DE ENSAYOS QUIMICOS,

Ing. Bolívar Cano

MICROBIOLOGICOS Y BROMATOLOGICOS DIRECCION DE PROTECCION AL

Dra. Hiparía Navas S. (Secretaria Técnica)

CONSUMIDOR Y DIRECCION DE NORMALIZACION DIRECCION DE ENSAYOS QUIMICOS, MICROBIOLOGICOS Y BROMATOLOGICOS

Otros trámites:

El Consejo Directivo del INEN aprobó este proyecto de norma en sesión de 1995-01-10

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