RayBio® Human IL-1 Beta

IQELISA Kit

Departamento: Química y Medio Ambiente

Carrera: Técnico Universitario en Biotecnología
Fecha: 07/06/2023
Asignatura: Técnicas inmunológicas y moleculares
Alumno: Katherine Poblete
 Contexto del análisis
El ensayo inmunocuantitativo inmunoabsorbente ligado a enzimas (IQELISA) es
un kit que combina la especificidad de ELISA con la sensibilidad del PCR en
tiempo real. En especifico este kit mide la concentración de Human IL-1 Beta en
serum, plasma y sobrenadantes celulares. La medición de esta proteína tiene
varias aplicaciones en la investigación biomédica y en el diagnostico clínico.
Algunos de los principales estudios que se hacen son:
 Investigación de enfermedades inflamatorias como artritis reumatoide, la
colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn.
 Evaluación de infecciones, para determinar la presencia y gravedad de la
infección y monitorear la respuesta del sistema inmunológico al tratamiento.
 Diagnóstico y pronóstico de enfermedades: la concentración de IL-1 Beta
se ha utilizado como biomarcador para el diagnostico de diversas
enfermedades donde se ha encontrado que niveles elevados de la proteína
están asociados a enfermedades cardiovasculares, enfermedades
neurodegenerativas y ciertos tipos de cáncer.
 Evaluación de la eficacia de tratamientos: medir los niveles de IL-1 Beta
antes y después de los tratamientos ayuda a determinar si los fármacos
están haciendo el efecto esperado.

Condiciones experimentales
Condiciones de laboratorio
 Mantener el mesón de trabajo y materiales sanitizados.
 Uso obligatorio de guates, bata de laboratorio y mascarilla.
 Tener la zona de trabajo ordenada y con los materiales requeridos a
disposición.
 Hacer triplicados.
 Seguir las buenas practicas de laboratorio al trabajar con IQELISA:
1. Cambiar las puntas en cada pipeteo.
2. Asegurarse que cada tubo se encuentre bien mezclado, pipeteando
repetidamente.
3. Asegurarse que las muestras y los estándares estén a la misma
temperatura que la placa.
4. Al pipetear, dejar caer el liquido por el lado del pocillo.
5. Fijarse si hay burbujas en el pocillo, si las hay, removerlas agitando
la placa suavemente.
6. Cubrir la placa en cada incubación.
Reactivos
- Placa 96 pocillos para PCR, recubierta con anti-Human IL-1Beta.
- Buffer de lavado concentrado: 25 ml concentrado 20x.
- 2 soluciones estándar de Human IL-1Beta recombinante.
- Diluyente de ensayo B: 15 mL con concentración 5x.
- Reactivo de afinidad de deteccion para IL-1 Beta: 2 soluciones
concentradas 4x de anti-Human IL-1 Beta.
- Reactivo de deteccion IQELISA: 1 ml concentrado 10x.
- Solución Primer: 1,5 ml.
- PCR Master Mix: 1,4 ml.
- Buffer de preparación PCR: 1 ml con concentración 10x.
- Buffer de lavado final: 10 ml con concentración 10x.

Equipamiento
- Real time PCR
- Micropipetas de 2 µl a 1 mL.
- Pipetas de 1-25 mL.
- Computador con software para análisis de datos.
- Bloque calefactor o baño maría capaz de llegar a 80°C.
- Vortex.
- Agitador.

Preparación experimental
Materiales
- Puntas para micropipetas: se utilizan durante el pipeteo de las muestras y la
preparación de las diluciones. Estas se cambian cada vez que se pipetea
algún reactivo.
- Papel absorbente: se utiliza para el secado de la placa de 96 pocillos, en
cada lavado, para hacer un secado boca abajo de la placa.
- Probetas graduadas de 100 mL a 1 L: se utilizan para la preparación del
Buffer de Preparación de PCR y del Buffer de Lavado Final.
- Agua destilada o desionizada: utilizada para la preparación de los
diluyentes, de los buffers de lavado, del Reactivo de Detección IQELISA y
de los estándares.
- Gradilla para eppendorf: utilizada durante la preparación de los reactivos.
- Tubos eppendorf de 2 a 5 mL: utilizados para hacer diferentes diluciones de
buffers de lavado, las muestras y los diluyentes.
 - Film para placa PCR: se utiliza al final del procedimiento, previo a entrar a
la maquina de Real Time PCR, esta debe crear un sellado para cada pocillo
de forma individual, por lo que debe quedar bien sellado, repasando todos
los bordes de la placa.
- Gradilla para placa de 96 pocillos: se utiliza durante todo el procedimiento
de ensayo para tener un apoyo de la placa de PCR y se pueda trabajar de
forma más segura.
- Marcador: utilizado para la rotulación de las muestras.

Ejecución experimental
Preparación de los reactivos
1. Traer los buffers de lavado, muestras, kit de diluyentes, y la placa de PCR
al mesón de trabajo a temperatura ambiente (18-25°C) antes de usar. PCR
master mix y la solución Primer se deben mantener a 4°C todo el tiempo.

2. Solución de muestra: si las muestras se necesitan diluir, usar el Diluyente

de ensayo B con concentración de 1x para la dilución de muestras de
serum/plasma.

3. El Diluyente de ensayo B se debe diluir 5 veces con agua desionizada.

4. Agitar brevemente los anticuerpos de detección antes de usar. Añadir 25 uL

de Diluyente de ensayo B 1x al frasco para preparar el concentrado de
anticuerpos de detección. Pipetear mezclando suavemente. Este
concentrado debiera ser diluido 80 veces con el Diluyente de ensayo B y
usado en el 4 paso del Procedimiento de Ensayo.

5. El buffer de preparación de PCR debiera ser transferido a un tubo de 15 mL

y diluido con 9 mL de agua destilada o desionizada, por cada 1 mL de
concentrado 10x utilizado antes de su uso.

6. El buffer de lavado final debe ser transferido a un tubo de 15 mL y diluido

con 9 mL de agua desionizada o destilada por cada 1 mL de concentrado
10x utilizado antes de su uso.

7. Preparación del estándar: Agregar 880 uL de Diluyente de ensayo A al

frasco para preparar un estándar de 20 ng/mL. Disuelve completamente el
polvo mezclando suavemente. Agregar 5 uL del estándar IL-1 Beta del
 frasco de estándares a un tubo con 995 uL de Diluyente de ensayo A para
preparar una solución estándar de 100 pg/mL. Utiliza la solución estándar
de 100 pg/mL para producir una serie de diluciones (mostradas a
continuación) pipeteando 400 uL de Diluyente de ensayo A en cada tubo y
transfiriendo 100 uL del estándar anterior al nuevo tubo. Mezcla cada tubo
completamente antes de la siguiente transferencia. El Diluyente de ensayo
A o el Diluyente de ensayo B al 1x se utiliza como estándar cero (o pg/mL)

8. Si el buffer de lavado concentrado 20x contiene cristales visibles, caliéntalo

a temperatura ambiente y mezcla suavemente hasta que se disuelvan.
Diluye 20 mL de buffer de lavado concentrado en agua desionizada o
destilada para obtener 400 mL de buffer de lavado al 1x.

9. Para preparar el reactivo de detección IQELISA, calcula la cantidad

necesaria multiplicando el numero de pocillos a analizar por el volumen que
planeas utilizar por pocillo. Una vez que se conozca el volumen del reactivo
de detección IQELISA, prepáralo diluyéndolo en una proporción de 1:10 con
agua desionizada y mezclando completamente.

Procedimiento de ensayo
1. Asegúrate de llevar todos los reactivos y muestras a temperatura ambiente
(18-25°C) antes de su uso. Se recomienda que todos los estándares y
muestras se analicen por triplicado.

2. Agrega 10 a 25 uL de cada estándar (ver paso 2 de la preparación de

reactivos) y muestra en los pocillos correspondientes. Los volúmenes
deben ser consistentes entre todos los pocillos, muestras y estándares. Se
 puede utilizar tan solo 10 uL si el volumen de la muestra es limitado, sin
embargo, esto aumenta la posibilidad de error técnico. Asegúrate que no
haya burbujas presentes en el fondo de los pocillos. Elimina cualquier
burbuja golpeando suavemente o utilizando la punta de una micropipeta,
teniendo el cuidado de no tocar los lados ni el fondo del pocillo. Cubre los
pocillos e incuba durante 1,5 a 2,5 horas a temperatura ambiente.

3. Descarta la solución y realiza 4 lavados con Solución de Lavado 1x. lava

llenando cada pocillo con Buffer de Lavado (100 uL) utilizando una
micropipeta o un autolavador. Es esencial eliminar por completo el líquido
en cada paso para un buen rendimiento. Después del ultimo lavado, elimina
cualquier resto de Buffer de Lavado aspirando o decantando. Invierte la
placa y sécala presionándola contra toallas de papel limpias.

4. Agrega 25 uL de Anticuerpo de Detección preparado (paso 4 de la

preparación de reactivos) a cada pocillo. Incuba durante 1 hora a
temperatura ambiente con una agitación suave.

5. Descarta la solución. Repite el lavado como se indica en el paso 3.

6. Agrega 50 uL del reactivo de detección IQELISA preparado e incuba

durante 1 hora con agitación suave (paso 9 de la preparación de reactivos).

7. Descarta la solución. Repite el lavado como se indica en el paso 3,

realizando un total de 6 lavados.

8. Agrega 25 uL del Buffer de Lavado Final a cada pocillo e incuba durante 4

minutos con agitación suave. Retira la solución de cada pocillo y sécala
presionándola contra toallas de papel.

9. Agrega 75 uL de Buffer de Preparación PCR 1x a cada pocillo e incuba

durante 10 segundos antes de retirar el buffer. Luego de reitar el buffer,
seca la placa presionándola contra toallas de papel.

10. Agrega 10 uL de la solución de os Primers a cada pocillo de la placa. En

esta etapa, la placa puede ser cubierta y almacenada a -20°C para su uso
al día siguiente si es necesario.

11. Agrega 10 uL del Master mix PCR a cada pocillo y pipetea de manera
completa para mezclar bien el contenido del pocillo (al menos 3 veces
arriba y abajo).
 12. Cubre la placa con Film para placa de PCR, asegurándote de presionarla
de manera completa y uniforme sobre la placa, creando un sellado
hermético alrededor de cada pocillo.

13. Coloca la placa el equipo de PCR de tiempo real utilizando una longitud de
onda compatible con FITC para la detección, con la siguiente configuración
para el ciclo de amplificación:
1) Activación durante 2 minutos a 95°C.
2) Desnaturalización durante 15 segundo a 95°C.
3) Anillado/Extensión durante 25 segundos a 60°C.
4) Repite los pasos 2 y 3 un total de 34 veces.

Obtención de resultados
Resultados
Los primeros datos obtenidos del kit son los valores Ct. Estos proporcionan
información sobre la cantidad relativa de material genético presente en una
muestra analizada. Por lo tanto, a niveles mas altos de ADN (relacionados
directamente con la cantidad de antígeno de la muestra) resultan en valores de Ct
más bajos, mientras que un valor Ct más alto indica que el ADN era menos
abundante.
Se calcula el valor de Ct promedio para cada conjunto de estándares, controles y
muestras en triplicado. Resta el valor de Ct de cada muestra al del control para
obtener la diferencia entre el control y la muestra (delta Ct). Grafica los valores de
los estándares en un grafico utilizando una escala logarítmica para la
concentración en el eje x. este grafico es la forma más rápida de visualizar los
resultados, aunque no la mas precisa. Si se utiliza este método, se puede estimar
la concentración de las muestras desconocidas utilizando una línea logarítmica de
menor ajuste.
La línea de mejor ajuste tendrá una ecuación y=mln(x) + b, donde y es el valor de
delta Ct y x es la concentración. Se recomienda utilizar 5 cifras significativas para
minimizar errores de redondeo. Para calcular la concentración de una muestra
desconocida, se puede ingresar en Excel en el siguiente formato:
=EXP((y-b)/m)
Donde y es el valor de delta Ct obtenido durante el ensayo, y b y m se obtienen de
la línea de menor ajuste.
También se puede utilizar una regresión lineal. Tanto delta Ct como la
concentración se pueden transformar utilizando un logaritmo en base 10, se
grafican en un gráfico, junto con la línea de menor ajuste. La ecuación de esta
línea se puede utilizar para calcular la concentración de antígeno de muestras
desconocidas.

Resultados del qPCR y curva estándar.

Errores
Problema Causa Solución
Curva de  Pipeteo inexacto.  Chequeo de micropipetas.
calibración  Dilución incorrecta de  Centrifuga brevemente los
deficiente los estándares. estándares y disuelve
completamente el polvo
mediante una mezcla
suave.
Baja señal  Tiempos de  Asegurarse de tener
incubación breves. suficiente tiempo de
 Volúmenes incubación. El paso 2 del
inadecuados de procedimiento de ensayo
reactivo o dilución puede realizarse durante la
incorrecta. noche.
 Verificar las micropipetas y
asegurarse de realizar una
preparación correcta.
Coeficiente de  Pipeteo desigual.  Verificar las micropipetas.
variación alto  Presencia de  Golpear suavemente o
burbujas en los utilizar la punta de una
pocillos. micropipeta para desalojar
el fondo del pocillo.
Fondo alto  La placa no está  Revisa el manual para
 suficientemente realizar el lavado de forma
lavada. adecuada. Si estas
 Buffer de lavado utilizando un lavador de
contaminado. placas, asegúrate de que
 Temperatura de todos los puertos estén
desnaturalización desobstruidos.
(Tm) inadecuada.  Preparar un nuevo Buffer de
lavado.
 Verifica los parámetros de
ejecución y calibra el
instrumento.
Baja sensibilidad  Almacenamiento  Almacenar el estándar a <-
incorrecto del kit 20°C después de la
IQELISA. reconstitución, y los demás
 Temperatura de a 4°C.
desnaturalización  Verifica los parámetros de
(Tm) inadecuada. ejecución y calibra el
instrumento.