PRÁCTICA 2. INTRODUCCIÓN AL ELISA.

DETECCIÓN DE ANTICUERPOS

Madalo Diawara Bangoura 2º A LAB

OBJETIVOS
• Familiarizarse con la técnica general de un ELISA.
• Realizar una detección cualitativa de anticuerpos mediante la técnica ELISA.
• Conocer los diferentes pasos y reactivos utilizados en un enzimoinmunoanálisis.

INTRODUCCIÓN
En la práctica de hoy, vamos a detectar anticuerpos utilizando la técnica ELISA. La ELISA es
un inmunoensayo que permite detectar tanto anticuerpos como antígenos. La ELISA tradicional,
lo que se tapizan son los anticuerpos y luego se incuba con la muestra problema que contienen
los antígenos, y por último se añade un anticuerpo secundario marcado con un enzima y un
sustrato para revelar la formación del inmunocomplejo

La ELISA indirecta se utiliza para detectar anticuerpos en una placa de microtitulación, y

permite cuantificar las respuestas inmunitarias. A diferencia del ELISA tradicional, en el
indirecto, lo que se tapiza en la placa de microtitulación son los antígenos y se incuban con la
muestra problema que contendrá los anticuerpos que queremos cuantificar. Una vez, incubado
se añadirá un segundo anticuerpo marcado enzimáticamente que se unirá a ese anticuerpo
primario, y por último, se añadirá un sustrato para poder revelar la formación del
inmunocomplejo. Este sustrato en concreto será la peroxidasa de rábano picante.

MATERIALES

• Tampón de reconstitución antígeno.

• Antígeno suero (liofilizado).
• PBST (tampón de lavado).
• Anticuerpo primario (liofilizado).
• Anticuerpo secundario (liofilizado).
• Sustrato ABTS.
• Ácido aminosalicílico (co-substrato peróxido).
• Peróxido de hidrógeno estabilizado.
• Agua destilada.
• Vasos de precipitado.
• Micropipetas automática y puntas.
• Guantes de laboratorio.
METODOLOGÍA
Primera parte. Tapizado del antígeno
- Etiquetar los pocillos de la placa de microtitulación en el lateral izquierdo enumerarlos del 1
al 4 y en lado a arriba enumerarlos de A a C.
- Etiquetar 10 pipetas Pasteur que se utilizaran para retirar el líquido tras cada incubación o
lavado.
- En los pocillos de las filas 2, 3 y 4, añadir 50 uL de la solución de antígeno (Ag).
- Incubar la placa a temperatura ambiente durante 8 min.
- Usando la pipeta (Ag) retirar todo el líquido de los pocillos.
- Usando la pipeta de PBS, lavar cada pocillo agregando, primero, 200 uL de PBS y
eliminándolo posteriormente.
- Repetir el lavado una vez más.

Segunda parte. Incubación anticuerpo primario

- En los pocillos de las filas 1, 2 y 4 añadir 50 uL de la solución de anticuerpo primario (Ac
1º).
- Incubar la placa a temperatura ambiente durante 8 minutos.
- Usando la pipeta de cada fila retirar todo el líquido con los Ac 1º sobrantes de los pocillos.
- Usando la pipeta de PBS, lavar cada pocillo agregando, primero, 200 uL de PBS y
eliminándolo posteriormente.
- Repetir el lavado una vez más.

Tercera parte. Incubación del anticuerpo secundario

- En todos los pocillos de todas las filas, añadir 50 uL de la solución del anticuerpo
secundario (Ac 2º).
- Incubar a temperatura ambiente durante 8 minutos.
- Usando la pipeta de cada fila retirar todo el líquido con los Ac 2º sobrantes de los pocillos.
- Usando la pipeta de PBS, lavar cada pocillo agregando, primero, 200 uL de PBS y
eliminándolo posteriormente.
- Repetir el lavado una vez más.

Cuarta parte. Adición del sustrato

- En los pocillos de las filas 1 y 2 agregar 50 uL de la solución de sustrato 1 (S1).
- En los pocillos de las filas 3 y 4 agregar 50 uL de la solución de sustrato 2 (S2).
- Incubar la placa a temperatura ambiente durante 8 minutos.
- Leer los resultados cualitativos mediante la aparición o no de color en los pocillos.
RESULTADOS
Antes de añadir el sustrato Después de añadir el sustrato

ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

Como he dicho anteriormente la ELISA indirecto es la formación de un inmunocomplejo entre
el antígeno, el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario marcado enzimáticamente-
sustrato.

Por un lado, en la fila 2 podemos ver que al añadir el sustrato y se ha revelado la formación del
inmunocomplejo entre el antígeno y los anticuerpos que queremos detectar. Por otro lado, en la
fila 4 debería haber pasado la misma situación al añadir el sustrato 2 pero puede ser que las
uniones entre los antígenos y los anticuerpos no sean tan fuertes como en el primer caso, ya sea
porque halla inmunocomplejos que estuviesen en una dirección incorrecta dificultando su unión
con el anticuerpo secundario o debido a una contaminación a la hora de intercambiar las pipetas.

En el caso de la fila 1, podemos ver que en el pocillo B de la fila 1 hay un pequeño halo de color
de color marrón, debido a que, a la hora de fijar los antígenos, hemos añadido sin querer un
poco de antígeno, creando un falso positivo.

CONCLUSIONES
En conclusión, aunque la practica no halla salido tal y como pensábamos, hemos podido ver
más o menos como funciona una técnica ELISA y nos hemos podido dar cuenta de la
importancia que tiene a efectos clínicos y de lo importante que es seguir rigurosamente todos
sus procedimientos, ya que de no hacerlo o si nos equivocamos en uno de los pasos, puede dar
lugar a falsos positivos o a falsos negativos, que, a efectos prácticos, pueden desencadenar en un
mal diagnóstico de alguna enfermedad.

Para la próxima práctica, tendremos en cuenta los errores cometidos en esta práctica, como la
contaminación cruzada, e intentaremos obtener de la mejor manera posible el resultado que se
espera.