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Universidad Pedagógica Nacional

Facultad de Ciencia y Tecnología


Departamento de biología
Biología Molecular
Silvia Gómez
Octubre - 2019

Laboratorio de Extracción del DNA.

Integrantes: Brandon Bolivar; Jenny Alejandra Neira; Royer Santiago Ramírez; Brahian
Alejandro Sierra.
INTRODUCCIÓN
La extracción de DNA es una de las técnicas más antiguas que se han realizado en el campo
de la biología molecular y data de 1869 cuando Miescher lo aisló por primera vez. El suizo
Miescher, aisló núcleos a partir del pus de vendajes utilizados en pacientes hospitalizados.
Tras un tratamiento simple, comprobó que estaban formados por una única sustancia química
muy homogénea y no proteica, que denominó nucleína (sustancias ricas en fósforo
localizadas exclusivamente en el núcleo celular). (Claros, 2003).
El ADN es una molécula que contiene la información esencial para el desarrollo y
funcionamiento de todas las formas de vida, almacena y mantiene la información genética y
funcional que pasa de generación a generación en los organismos, permitiendo el
mantenimiento de las especies al ser responsable de la transmisión hereditaria (Curtis, H;
Barnes, N. S. et al. 2007).
Químicamente está conformada por una doble hélice con giro a la derecha (dextrógira); que
está constituida por un esqueleto de fosfato y azúcar en el exterior y bases nitrogenadas en el
interior unidas por puentes de hidrogeno. Este modelo fue propuesto por Watson, Crick y
Wilkins, en 1953 y es conocido como “el modelo de la doble hélice”; fue publicado en la
revista Nature y describe lo que hoy se conoce como DNA-B. Estos investigadores se basaron
para su propuesta en las investigaciones de difracción de rayos X reportadas por R. Franklin
(Claros, 2003).
La hebra simple de la molécula del DNA (ácido desoxirribonucleico) está formada por
monómeros de nucleótidos. Estos a su vez están constituidos por un grupo fosfato que le da
carácter ácido y negativo a la molécula, un azúcar de cinco carbonos (desoxirribosa) y bases
nitrogenadas (Curtis, H; Barnes, N. S. et al. 2007). Por otra parte, las bases nitrogenadas
están unidas por puentes de hidrógeno (uniones entre átomos de nitrógeno-hidrógeno o
hidrógeno-oxígeno) De manera específica, donde la adenina se une con la timina y la guanina
con la citosina. El número de purinas siempre es igual al número de pirimidinas con una
relación molecular 1:1, este es un valor constante para cada especie animal y a esto se le
conoce como la equivalencia de bases de Chargaff. A causa de la especificidad de las bases
nitrogenadas las cadenas de ADN son complementarias (Karp, 2006).
Los nucleótidos se unen para formar la cadena sencilla de ADN, mediante enlaces
fosfodiester (enlaces covalentes) que unen al grupo hidroxilo 3’ de un azúcar de un
nucleótido con el grupo fosfato 5’ del azúcar adyacente del nucleótido entrante (Karp, 2008).
Para aislar el DNA cromosómico o estracromosómico de los otros componentes celulares
como las proteínas, carbohidratos, lípidos y RNA. Por lo general se utiliza el mismo
procedimiento en todos los organismos (homogenización de muestra o concentración de
muestra a trabajar, lisis celular, eliminación de moléculas contaminantes y precipitación del
ADN) con algunas variaciones en los métodos físicos y químicos que dependen de: grado
pureza que se requiere para procedimientos posteriores, cantidad de DNA requerido, cantidad
de muestra con que se cuenta y tipo de muestra.
OBJETIVOS
Objetivo General:
Objetivo Específico:
● Aislar la molécula del DNA Cromosómico (animal y vegetal) y ADN extra-
cromosómico (bacterias).
● Analizar los diferentes de extracción de ADN
● Identificar la importancia del ADN en los seres vivos.

MATERIALES
Extracción de DNA Hígado y Banano Extracción de DNA plasmídico

Hígado crudo congelado y banano fresco Cepa de Bacillus thuringiensis (3), 500μl de
(5gr, aprox); Mortero (1); Agua destilada solución de lisis, micropipetas de 1000ul,
estéril (50ml); Erlenmeyer (50ml); Arena 500μl de cloroformo-alcohol isoamilico,
estéril (2gr); Gaza estéril (1); jabón para centrifuga, 1000μl de etanol frío -20°C,
lavar platos disuelto en agua, Embudo de 1000μl de etanol al 70% frío -20°C, 30μl de
vidrio (1); Ablandador de carne, tubos de agua destilada desionizada estéril, asa (1),
ensayo de 20 ml; Etanol 95% a – 20°C, mechero (1), tubo eppendord
Gradilla para tubo de ensayo de 20 ml (1);
Extracción de DNA Cromosómico o Materiales generales:
genómico.

2 a 5 ml de sangre con EDTA no heparina,


centrifuga, gradilla para tubo eppendord,
tubos eppendord, toallas de papel,
micropipetas de 1000ul, puntas azules para
la micropipeta, agua, marcador punta fina
para tubos (sharpie), kit CorpoGen DNA
2000: solución de lavado, solución de lisis,
solución salina, solución reconstituyente
Etanol 100% o isopropanol.

Tomado de:
PROCEDIMIENTO

Diagrama 1. Diagrama de extracción de ADN plasmídico de una cepa de Bacillus


thuringiensis. Laboratorio de Extracción de DNA
Diagrama 2. Diagrama de extracción de ADN de Banano o Hígado. Laboratorio de
Extracción de ADN
Diagrama 3. Diagrama de extracción de DNA cromosómico o genomico. Laboratorio de
extracción de DNA
MARCO TEÓRICO
DNA (ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO)
Se encuentra clasificado entre las macromoléculas más importantes para los diversos
procesos celulares. es el código genético universal, está modelizado como una estructura de
doble hélice antiparalela y complementaria propuesto por Watson y Crick (Campbell &
Reece, 2005) la cual está compuesta por bases nitrogenadas (A,G,C,T) que son capaces de
formar nucleótidos (Estructura molecular entre una Azúcar pentosa, un Fosfato y la Base
Nitrogenada) que especifican composiciones genéticas a cada individuo, estas últimas
encargadas a su vez de formar aminoácidos por procesos de replicación y traducción cuando
se disponen en tripletes por medio de diferentes enlaces químicos.

http://2.bp.blogspot.com/-4aWjrc-L8e0/UGtkDN1xMdI/AAAAAAAAECw/1DbnZW26u7U/s1600/Image16676.gif8

Extracción del DNA

Para la extracción de DNA en distintos organismos se deben utilizar diferentes metodologías


para el reconocimiento del material genético, así mismo para cumplir algunos criterios
básicos para la extracción. según Carvajal (2018) se encuentra métodos sistematizados y
especializados para distintas investigaciones (muestras de sedimentos, suelos, microbiota de
los seres humanos, organismos de producción agrícola).
http://www.labome.es/method/DNA-Extraction-and-Purification.html
Resultados
Laboratorio N°1: Banano- marihuana.
-Se realizaron los diferentes procedimientos para la extracción del material genético (ADN)
de estos 2 materiales vegetales diferentes

Maceración de la muestra de Banano.( Mismo


procedimiento para las 2 muestras) Foto tomada por: Ramirez, R (2019). Laboratorio de
extracción de DNA.

Resultado de la extracción con la muestra de banano: Fotos tomadas


por: Ramirez, R (2019). Laboratorio de extracción de DNA.

Resultado de la extracción con la muestra de Marihuana: Fotos tomadas por:


Ramirez, R (2019). Laboratorio de extracción de DNA.
-Encontramos diferentes resultados al momento de dar por terminada la extracción, en primer
lugar la muestra del banano al realizarle los diferentes procedimientos, no se hace evidente
la separación entre los compuestos de ADN y los demás de la solución que se encuentra en
el tubo de ensayo, entendiendo que no se logra evidenciar por varios motivos, como la
extrema maduración del tejido, mala lisis celular o poca cantidad de ADN con la que cuenta
el tejido.
En segundo lugar, se logra evidenciar el ADN sobrenadante en el tubo de ensayo de la
extracción que se le realizó a las hojas de marihuana, un resultado totalmente diferente al
cual se llegó con la extracción del banano. Es este resultado se logra evidenciar puntualmente
un sobrenadante de gran espesor a diferencia de la extracción al hígado. en la discusión con
los compañeros del grupo del por que se da este resultado, se llega a varias conclusiones,
tales como: la cantidad de material vegetal que se utilizó, difiere bastante a la consistencia y
composición del banano, además de encontrar diferentes oscilaciones en los resultados a
causa de ablanda carnes de diferentes fabricantes, encontrando que uno de ellos hace más
eficaz el proceso de lisis celular.
Laboratorio N°2: Sangre:

Muestras de
Sangre Fotos tomadas por: Ramírez, R (2019). Laboratorio de extracción de DNA

Centrifugación de las muestras de sangre. Fotos tomadas


por: Ramirez, R (2019). Laboratorio de extracción de DNA
Laboratorio N°3: Hígado

Laboratorio N°4: Bacteria (DNA plasmídico).

Análisis de Resultados
El proceso de la extracción de ADN debe cumplir con ciertos protocolos que generen así
resultados confiables y precisos es por esto que, inicialmente, la colecta de la muestra y su
manejo son indispensables para la extracción de ADN exitosa. Una colecta y manejo
apropiado de la muestra permite obtener ADN íntegro y sin contaminantes, los cuales afectan
la acción la acción de las enzimas durante la reacción de PCR. Así pues, teniendo en cuenta
las recomendaciones sobre la colecta y manejo de algunos tejidos de plantas y animales.
Inicialmente en el caso de las plantas se recomienda colectar tejido joven pues contiene más
células por unidad de peso que el tejido viejo y posee menos polisacáridos y polifenoles que
dificultan la extracción (Alejos, Aragón & Romero., s.f). En este sentido, en el caso
específico del protocolo casero para la extracción de ADN de banano, la fruta utilizada ya se
encontraba bastante madura (tejido viejo) y posiblemente por este motivo no fue posible
observar el ADN en el paso final del protocolo, asimismo sucedió con el brócoli el cual
tampoco se pudo evidenciar. Por el contrario, con las hojas de la planta de marihuana, las
cuales se encontraban frescas y recién extraídas (tejido joven) sí se logró observar el ADN
extraído, por medio del conjunto de una sustancia blanca espesa y con ramificaciones (forma
de hilos) ubicada en la parte superior del tubo de ensayo, siendo el ADN separado de las
demás sustancias y componentes como los lípidos y algunas de las proteínas que lo
componen.
Por otro lado, en cuanto al tejido animal utilizado, hígado de res, este se encontraba fresco y
fue necesario cortar el tejido en pedazos pequeños para facilitar su masa como su maceración
posterior. De acuerdo al protocolo con el hígado éste igualmente fue exitoso, debido a que se
logró observar el ADN de color blanco, sustancia de textura espesa y bastante compacta,
ubicado igualmente en la parte superior del tubo de ensayo. Asimismo, para la colecta de
sangre el protocolo a seguir es estricto, en el cual se deben utilizar agujas de calibre
apropiado, respetar la relación muestra/anticoagulante y homogeneizar correctamente la
muestra para evitar la hemólisis (el cual libera hemoglobina, contaminante e inhibidor de las
reacciones enzimáticas) y/o coagulación y la contaminación bacteriana. En este sentido la
coagulación implica distintas reacciones enzimáticas que dependen del calcio. Los buffers
contienen reactivos que evitan la coagulación, como el EDTA, la heparina y el citrato de
sodio. Por su parte el EDTA elimina el calcio de la sangre e impide la acción de las enzimas
necesarias en la coagulación. Se utiliza en la proporción de 1 mg/ml de sangre (válido para
todas las especies) (Alejos, Aragón & Romero., s.f).
Así pues, para continuar con el proceso de extracción, la homogeneización del tejido tanto
mecánica como química consiste en romper las uniones entre las células para facilitar las
interacción con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material genético. De acuerdo
a la práctica de laboratorio, la maceración de los tejidos vegetales y animales se llevó a cabo
por la homogeneización mecánica en el uso de pistilos y morteros, los cuales disgregan la
muestra mediante con la fricción de la pared del tubo que contiene la muestra, adicionalmente
se utilizó 1 gr de arena como material abrasivo que permite triturar y romper más fácilmente
los tejidos utilizados. En algunos protocolos de la práctica fue necesario utilizar buffer o
solución de lisis antes de iniciar, ya que estas soluciones desnaturalizan a las proteínas y
mantienen estable al ADN. El uso del mortero y pistilo se recomienda en general para
muestras pequeñas y tejidos blandos, aunque también se usa para tejidos no fibrosos como
hojas jóvenes o flores (Alejos, Aragón & Romero., s.f).
En cuanto al proceso de lisis celular las interacciones entre las moléculas que conforman la
pared, la membran celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los ácidos
nucléicos se liberen, por ende se utilizan soluciones básicas, como detergentes caotrópicos
que permiten disolver la membrana celular, así como inhibidores para inactivar las enzimas
que degradan el ADN. En este sentido, se utilizó jabón en barra para cocina adicionado con
agua, el cual dio buenos resultados en el procedimiento de la planta de marihuana y el hígado
ya que rompió efectivamente la composición de la membrana plasmática (bicapa de
fosfolípidos), la pared celular y la envoltura nuclear, pasos preciso para la extracción y
observación del ADN de forma exitosa. De la misma manera, muchas soluciones de lisis
contienen también EDTA, que forma un complejo con los iones de Mg e impide el
funcionamiento de las DNasas Sambrook, et al. 1989 (citado por Alejos, Aragón & Romero.,
s.f). Los componentes celulares no solubles como el material fibroso y proteínas que
permanecen en solución se separan del ADN por centrifugación.
A partir del protocolo tradicional utilizado en el laboratorio, en la etapa de la separación de
las proteínas y lípidos, el ADN se separa de estos dos componentes mediante solventes
orgánicos y ciclos de centrifugación. Según lo plantea Sambrook, et al. 1989 (citado por
Alejos, Aragón & Romero., s.f) se utiliza la fuerte tendencia de los grupos fosfato para
separarlos en medios acuosos, mientras que las proteínas y los lípidos se separan en solventes
orgánicos; los solventes usados frecuentemente son el fenol, cloroformo y el alcohol
isoamílico. La fase acuosa y la orgánica se separan por centrifugación lo que permite aislar
el ADN. En cuanto a la precipitación del ADN, con la adición de etanol y soluciones con
altas concentraciones de sodio o amonio, se genera una reducción de las fuerzas repulsivas
entre las cadenas haciendo que el ADN se pliegue sobre sí mismo pasando a ser insoluble; y
antes que el etanol sea desechado el ADN permanece en el fondo del tubo del ensayo.
Posteriormente, cuando se elimina el etanol es necesario hidratar el ADN para mantenerlo
en solución (si se hace con agua el pH debe ser de 7 para lograr una redisolución completa
del ADN. Por consiguiente, cuando se utiliza una solución amortiguadora, es preferible
utilizar una solución de Tris- HCl a 10 mM y EDTA a 0.1 M a un pH de 8.0 para almacenar
el material. Tanto la solución de Tris y EDTA se utilizaron pero con diferencia en distintas
concentraciones y un mismo pH; cuya solución amortiguadora, también llamado reguladora
o tampón tiene como función mantener el pH de dicha disolución debido a la adición de cierta
cantidad de ácido o base fuerte presentada en la extracción del ADN elaborado en el
laboratorio (Alejos, Aragón & Romero., s.f).
Por otro lado, los plásmidos son elementos genéticos extracromosómicos que se han
encontrado esencialmente en todos los tipos de bacterias estudiadas hasta la fecha.
Dependiendo de su tamaño pueden codificar cierta cantidad de proteínas o muchas de estas.
Raramente, codifican productos esenciales para el crecimiento celular, como ARN
polimerasas o enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Los plásmidos varían
ampliamente en tamaño, desde miles a cientos de miles de pares de bases (tamaño
comparable al cromosoma bacteriano) y son, con mayor frecuencia, moléculas circulares de
ADN de doble cadena, sin embargo algunas bacterias poseen plásmidos de estructura lineal.
El contenido celular de los cultivos bacterianos se concentra por centrifugación y se lisa por
diferentes métodos que incluyen tratamiento con álcalis o calor, detergentes iónicos o no
iónicos y disolventes orgánicos (Coll, Coque, Domínguez, Vázquez & Vila, 2005).
Cuestionario
1. ¿Por qué es posible utilizar el ADN para el reconocimiento de los individuos?
Es posible la utilización del ADN para el reconocimiento de los individuos debido a que el
ADN posee una organización propia para cada uno de ellos, ya que cada individuo cuenta
con una secuencia de información química que determina la morfología, el comportamiento
y la fisiología, lo cual determina su propio código genético. El número de veces que se repite
esta unidad de secuencia presenta una gran variabilidad entre los individuos de una
población. Por esta razón, en el caso del ser humano, mediante la determinación de diferentes
pruebas de laboratorio se puede identificar un individuo, a partir de los vestigios biológicos
que se encuentren; identificación de restos humanos y personas desaparecidas y la
investigación biológica de la paternidad y otras relaciones de parentesco. Estos
procedimientos para el reconocimiento de los individuos es posible gracias a un perfil
genético, que es un patrón de fragmentos cortos de ADN ordenados de acuerdo a su tamaño
que son característicos de cada individuo, así pues, este patrón se convierte en un código
numérico para almacenar y comparar con un alto poder de discriminación.
2. ¿Explique por qué el detergente produce lisis de las células?
La función del detergente en la extracción del ADN es ayudar a romper la pared celular si es
el caso, como los enlaces de la bicapa fosfolipídica de la membrana y después la envoltura
nuclear respectivamente, para así llegar al núcleo y dejar libre el material genético. Las
uniones de los lípidos que mantienen la membrana compacta se descomponen debido al
detergente el cual deshace estas uniones, rompe la unión de los enlaces y hace posible llegar
hasta donde se encuentra el material genético ADN.
3. En el protocolo de extracción del ADN casero ¿Cómo actúa el ablandador de carne
en la en la célula?
En el momento que se lisan las células, se liberan gran cantidad de proteínas, donde algunas
de estas tienen la finalidad de degradar al ADN de patógenos como las bacterias y los virus.
Por consiguiente si no se detiene la acción de estas proteínas (conocidas como nucleasas) el
ADN será degradado. Es por esto que se agrega el ablandador de carne, el cual contiene
proteasas, que son proteínas especializadas en la degradación de otras proteínas para evitar
la degradación así del ADN.
4. Cuál es la función del tris y del EDTA en los buffers de extracción de ADN?
A) el Tris ( Hidroximetil aminometano) su función en los buffer del proceso de
extracción es generar un tampón biológico , cuya tarea es mantener el pH de la
solución constante ( pH 7.0 - pH 8.0)
B) el EDTA (Ácido etilen diamino tetra acético) Es un agente antagonista de iones
metálicos como el calcio, el magnesio. Inhibidor de la acción de las enzimas del
núcleo, al no dejar cofactores libres para la actividad, así protegiendo el DNA:
5. ¿Cómo actúa la sal en los diferentes momentos del procedimiento en los diferentes
protocolos de extracción de ADN presencial (plasmídico y genómico)?
La sal tiene como función la precipitación del ADN en el alcohol. Teniendo en cuenta que la
molécula del ADN es soluble en agua e invisible, pero si se pone en contacto en un medio
salado y alcohol frío el ADN se vuelve insoluble y precipita. Igualmente la sal también tiene
como función la separación del ADN de las histonas.
6. En el laboratorio virtual ¿Cuál es la finalidad de colocar la muestra en un baño
termostático con agua caliente?
7. En el laboratorio virtual ¿cuál es el objetivo de agregar una solución con alta
concentraciónde sal?
8, 9 y 10. En un mapa conceptual haga un comparativo entre todos los protocolos
(laboratorio presencial y virtual). Tenga en cuenta todos los métodos físicos y químicos
utilizados. NOTA: no importa que solo haya realizado 2 protocolos presenciales pues
debió haber observado los resultados de sus compañeros.
11. ¿Cómo actúa el etanol o el isopropanol al 100% y cómo actúa el etanol o el
isopropanol al 70%?
12. ¿Qué conceptos abordaría usted en biología a partir de la extracción de ADN
plasmídico y del ADN total?

Conclusiones

Referencias Bibliográficas
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