Bioquímica–I

Grado en Medicina
ENZIMAS

1. Enzimas: Composición y Clasificación

2. Mecanismo de acción
3. Energía de Activación y Estado de Transición
4. Modelos de funcionamiento
5. Mecanismo de unión y catalítico
6. Uso de las enzimas en Medicina
 Son catalizadores biológicos → aceleran las velocidades
de las reacciones.
 La mayoría son proteínas aunque hay ARN con actividad
catalítica: Ribozimas.

 Su actividad catalítica depende

del mantenimiento de su
estructura:
 Funcionan en condiciones suaves
de pH y Tª.
 A veces tienen componente molecular adicional:
1. Cofactor o Coenzima
HOLOENZIMA
2. Apoenzima (Proteína)

SUSTRATO

APOENZIMA COFACTOR

→
O
COENZIMA
HOLOENZIMA
+ → Enzima + cofactor
(catalíticamente activo)
ENZIMAS: Cofactores y Coenzimas

 El componente molecular adicional:

1. Cofactor: iones metálicos.
La unión suele ser covalente: mediante un grupo no proteico
llamado grupo prostético.
2. Coenzima: complejo orgánico o metalo-orgánico.
La unión es transitoria. Son transportadores de grupos.
Ej. de Cofactor Apoenzima
Mg2+ Mg2+
Cofactor

Sustrato
Mg2+
ENZIMAS: Cofactores y Coenzimas
 Ej. de cofactor: Fe2+ unido al grupo prostético hemo de la
hemoglobina

Grupo hemo
 Cofactores: EJEMPLOS DE COFACTORES
COFACTOR ENZIMA
 Son iones inorgánicos: Cu2+
Citocromo Oxidasa, Amino
Oxidasa
Cu2+, Fe2+, Fe3+, Citocromo Oxidasa, Peroxidasa,
Fe2+ o Fe3+
K+, Mg2+, Mn2+, Catalasa
K+ Piruvato Quinasa
Ni2+, Se , Zn2+ Hexoquinasa, Glucosa-6-fosfatasa
Mg2+
Piruvato Quinasa
Arginasa, Ribonucleótido
Mn2+
Reductasa
Ni2+ Ureasa
Se Glutatión peroxidasa
Alcohol deshidrogenasa,
Zn2+
Carboxipeptidasas A y B
  Los COENZIMAS son transportadores de grupos.
 Se unen de forma transitoria.
 Ej.: Coenzima A; transportador de grupos acilo.

Sustrato con grupo acilo

Producto
=O

–C–CH3 –H Enzima acetil-transferasa

Sustrato

ApoenzimaEnzima acetil-transferasa

=O
Coenzima –S–C–CH3
–S–H
Coenzima A Coenzima A con grupo
(CoA) acilo (acetil CoA)
 Otras coenzimas con transportadores transitorios de
electrones.
H O 2 e– H H O
C C
 Ej.: NADH. NH2 NH2
2 H+ + H+

:
O–––CH2 O N N
NADH
–– –– –– ––

O=P–O– R (Reducido)

O
O=P–O–
Adenina
O–––CH2 O

NAD+
(Oxidado)
 Coenzimas
 Enzima Dihidrofolato reductasa.
 Reducción de DiHidroFolato a TetraHidroFolato.
DHF → THF
 Cofactor: NADH → NAD+.
  Las coenzimas provienen de las
Vitaminas B.
 En frutas y verduras.
EJEMPLOS DE COENZIMAS
Reacción catalizada por la
Precursor Coenzima
holoenzima
Tiamina (Vit. B1) Tiamina Pirofosfato Descarboxilación de oxoácidos
Riboflavina (Vit. B2) FAD, FMN Oxido-reducción
Niacina o ác. Nicotínico (Vit. B3) NAD+, NADP+ Oxido-reducción
Ác. Pantoténico (Vit.B5) Coenzima A Síntesis, oxidación de ác. grasos
Transaminación,
Piridoxina (Vit. B6) Piridoxal Fosfato
descarboxilación, racemización
Biotina (Vit B7) Biocitina Carboxilación
 CLASE FUNCIÓN SUBCLASES
Deshidrogenasas, Oxidasas,
Transferencia de Reductasas, Peroxidasas,
1. Oxidorreductasas
electrones Catalasa, Oxigenasas,
Hidroxilasas
Transaldolasas y Transcetolasas,
Transferencia de grupos
2. Transferasas Fosforiltransferasas, Quinasas,
funcionales
Fosfomutasas
Esterasas, Glucosidasas,
Peptidasas, Fosfatasas,
3. Hidrolasas Reacciones de hidrólisis Tiolasas, Fosfolipasas,
Amidasas, Desaminasas,
Ribonucleasas
 CLASE FUNCIÓN SUBCLASE

Rompen enlaces C–C, C–N o C–S, y Descarboxilasas, Aldolasas,

4. Liasas forma doble enlace en la molécula Hidratasas, Deshidratasas,
resultante o viceversa Sintasas, Liasas

Transferencia de grupos dentro de la Racemasas, Epimerasas,

5. Isomerasas
molécula Isomerasas, Mutasas

Condensación dependiente de
6. Ligasas Sintetasas, Carboxilasas
hidrólisis de ATP
2. Transferasas, ejs.: Transferencia de grupos funcionales.
 Aciltransferasa (utiliza coenzima A):
Colesterol-OH + Ester de colesterol (1 ác. graso)
Fosfatidilcolina (2 ác. grasos) + Lisofosfatidilcolina (1 ác. graso)

+ +

H
2. Transferasas, ejs.: Transferencia de grupos funcionales.
 Fosfotransferasa: transfiere un grupo Pi.
Glc +ATP → Glc-6P +ADP

 ARNr peptidil transferasa: es una ribozima de ARN ribosómico.

Trp + Ser → Trp-Ser

 Glucosiltransferasa: transfiere 3 Glc para desramificar.

(Glc α1-4 Glc)n + (Glc α1-4 Glc)4 → (Glc α1-4 Glc)n+3 +Glc α 1-4 Glc
de la ramificación → a la cadena larga
3. Hidrolasas, ejs.: con agua se rompe enlace condensación.
 Esterasa
Éster de colesterol Colesterol-OH + Ác. graso

+
3. Hidrolasas, ejs.: con agua se rompe enlace condensación.
 Glucosidasa:
Almidón (Maltosa)n + …

 Peptidasa:
Trp-Ser-Asn-Arg-Thr Trp-Ser + Asn-Arg-Thr

 Fosfatasa:
O- O-
R-O-P-O- R-OH + HO-P-O-
O O
4. Liasas, ejs.: rompe y forma doble enlace o viceversa.
 Aldolasa:
Fru 1-6 biP Gliceraldehído 3P + Dihidroxiacetona-P
O-
-O-P-O- O-
O -O-P-O-
O
O- +
-O-P-O-
O
O-
-O-P-O-
O
4. Liasas, ejs.: rompe y forma doble enlace o viceversa.
 Descarboxilasa (Con coenzima Tiamina Pirofosfato):
Piruvato (COO--CO-CH3) → Acetaldehído (CHO-CH3)

Piruvato
descarboxilasa
5. Isomerasa, ejs.: conversión de isómeros.
 Epimerasa:
Galactosa Glucosa
 Isomerasa:
Fructosa Glucosa
6. Ligasas, ejs.: condensación dependiente de hidrólisis ATP.
 Sintetasa:
Asp + Gln Glu + Asn
ATP ADP
 Carboxilasa:
Acetil CoA (CH3-CO-SCoA) Malonil-CoA (COO--CH2-CO-SCoA)
ATP ADP

CO2
 Fructosa 1,6 P → Dihidroxiacetona-3P + gliceraldehído-1P
 Maltosa + H2O → Glucosa + glucosa
 Glucosa-6P → Fructosa-6P
COO–

– – –
 Glucosa + ATP → Glucosa-6P + ADP HOCH
CH2
 Piruvato + CO2+ ATP → Oxalacetato + ADP + Pi COO–
L-Malato
COO–
COO– ATP ADP
– – –

C=O
– –

C=O
CH2
CH3 COO–
CO2 Pi COO–

– – –
C=O
Piruvato Oxalacetato CH2
COO–
 Malato+ NAD+ → Oxalacetato+ NADH + H+ Oxalacetato
EC1.2.3.4. (Enzyme Comission): http://enzyme.expasy.org/
1-Nombre de la clase o tipo de reacción.
2-Subclase o grupo funcional modificado.
3-, 4-Aspectos específicos de la reacción.

EC2.7.1.1 → hexoquinasa
2=transferasa.
7=fosfotransferasa.
1=grupo hidroxilo como aceptor.
1=D glucosa como aceptor del grupo fosforilo.
 ATP + creatina   ADP + fosfocreatina

• Nombre sistemático:
Grupo transferido

ATP: creatin fosfotransferasa

Donador Aceptor

• Número sistemático: Subgrupo

Grupo

Enzyme
comission
EC 2.7.3.2 Aceptor del
grupo donado
Grupo aceptor
1. Enzimas: Composición y Clasificación
2. Mecanismo de acción
3. Energía de Activación y Estado de Transición
4. Modelos de funcionamiento
5. Mecanismo de unión y catalítico
6. Uso de las enzimas en Medicina
 S + E ES EP E + P

Enzima Enzima

UNIÓN A
CENTRO ACTIVO
CATÁLISIS

Molécula S Complejo Complejo Molécula P

(sustrato) Enzima – Enzima – (producto)
Sustrato Producto
(ES) (EP)
 Se requiere un Centro activo:
Proporciona un ambiente específico para:
 Unir el sustrato: mediante algunos Aa de unión.
 Favorecer la reacción: mediante otros Aa catalíticos.

Centro
activo +

SUSTRATO
Residuos Polares COMPLEJO
ENZIMA Residuos Apolares
Residuos Polares ENZIMA-
Residuos Apolares SUSTRATO
 ¿Para qué son necesarias las enzimas?
Determinan la velocidad de una reacción.
 La espontaneidad energética (valor de ΔG),
no afecta a la velocidad.

 Existe una barrera energética: la energía

de activación. ¿Glucolisis?
 ENZIMA

 La combustión es una reacción espontánea, no instantánea.

 Se debe superar la barrera.
 Se requiere una ENZIMA (chispa).
1. Enzimas: Composición y Clasificación
2. Mecanismo de acción
3. Energía de Activación y Estado de Transición
4. Modelos de funcionamiento
5. Mecanismo de unión y catalítico
6. Uso de las enzimas en Medicina
 Es la barrera energética entre el
estado basal y el de transición.
Estado de
 Los reactivos deben alcanzar un Transición (‡)
estado de transición/activación
para transformarse en producto.

Energía libre, G
ΔG‡S→P ΔG‡
P→S
 Estado de transición:
momento molecular en el que Estado ΔGº
basal (S) Estado
es igual de probable que se basal (P)
forme P o S.
Coordenada de la reacción

 La enzima rebaja la energía

de activación radicalmente.
  Las enzimas, al disminuir la
Estado de energía de activación, aumentan
Transición (‡)
la velocidad de reacción.
Energía libre, G

ΔG‡Sin catalizar  Hay una relación matemática:

‡
ΔG‡Catalizado  la velocidad de una reacción es
S
P mayor cuanto menor sea la energía
de activación que debe superar el
Coordenada de la enzima (ΔG‡).
reacción  No hay ninguna relación con ΔG:
espontaneidad.
1. Enzimas: Composición y Clasificación
2. Mecanismo de acción
3. Energía de Activación y Estado de Transición
4. Modelos de funcionamiento
5. Mecanismo de unión y catalítico
6. Uso de las enzimas en Medicina
Los modelos de funcionamiento de las enzimas
deben considerar:
 La alta especificidad E-S: son muy específicas de S.

 La compensación entre energía de fijación y energía de

activación: interacciones débiles optimizadas en el
estado de transición.

 La complementariedad entre el centro activo y el

estado de transición, no con el sustrato.
  Sin enzima:

Sustrato Estado de Transición Productos ‡

(Vara metálica) (Vara doblada) (Vara partida)

Energía libre, G
ΔG‡

S
P
Coordenada de la reacción

 La barrera de activación es demasiado elevada para que los

sustratos la puedan superar por sí mismos, aunque se trate
de una reacción espontánea.
 Modelo de Fischer 1894: Modelo de llave – cerradura.
 El enzima es complementario al sustrato.
‡

Energía libre, G
ΔG‡Sin Cat.
ΔG‡Cat

S ΔGM
P
Coordenada de la reacción

 Explica la especificidad y complementariedad con el estado inicial.

 Pero no con el estado de transición.
 No explica la transformación a producto.
 Modelo Haldane 1930 y Pauling 1946.
 El enzima es complementario al estado de transición.
‡

Energía libre, G
ΔGM
‡ ΔG‡Sin Cat.
ΔG‡Cat.
S
P
Coordenada de la reacción
 El modelo implica escasa especificidad con el sustrato. No es real.
 Hay complementariedad con estado de transición.
 Hay compensación de energía en el estado de transición superando
la barrera de activación.
 Explica la transición a producto.
 Modelo de encaje inducido de Koshland:
Modelo guante-mano.
 La unión enzima-sustrato provoca la
deformación del centro activo.
 Hay especificidad por el sustrato.
 Al cambiar la conformación hay compensación de
E y complementariedad con el estado de transición.
 Explica la transformación en producto.
 Explica todo
Modelo del encaje inducido:
1. Enzimas: Composición y Clasificación
2. Mecanismo de acción
3. Energía de Activación y Estado de Transición
4. Modelos de funcionamiento
5. Mecanismo de unión y catalítico
6. Uso de las enzimas en Medicina
¿Cómo consiguen las enzimas rebajar la energía de
activación?
 Compensando mediante la Energía de Fijación.
Sucede al unirse E+S:
 Se alinean grupos que van a reaccionar.
 Se crean interacciones débiles.

 Compensando mediante la Energía de Catálisis.

Sucede al transformar el S en P:
 Se forman cargas inestables transitorias.
 Se forman enlaces covalentes y/o transferencias de grupos entre
E y S.
1. Energía de Fijación: Mediante ella las enzimas
compensan la energía de activación

Crean interacciones débiles entre la E y el S:

1. Puentes de H.
2. Puentes salinos. Con esto se consigue:
3. Fuerzas de Van der Waals.  alinear los grupos
4. Fuerzas hidrofóbicas. reactivos.
2. Mecanismo para la Catálisis: Mediante él las enzimas
compensan la energía de activación.
 Reordenamiento de los Con esto se consigue:
enlaces covalentes:  Formación cargas inestables
1. formación de enlaces transitorias.
entre enzima-sustrato.
 Creación de rutas alternativas
2. transferencias de grupo. de menor energía.

Aa catalíticos
 La unión y catálisis sucede en el Centro activo. Posee:

a) Sitio de unión:
Aa de unión.
Aa de unión
Aa de unión
b) Aa catalíticos:
Aa que transforman S en P.

Aa catalíticos
 ¿Cómo se reordenan los enlaces covalentes?
1. formación de enlaces entre enzima-sustrato.
2. transferencias de grupo.

 Catálisis ácido-base.

 Catálisis covalente.

 Catálisis por iones metálicos.

 Catálisis ácido-base:
 Aa básicos: Lys, Arg, His: –NH2+ → –NH .
 Aa ácidos: Asp, Glu: –COOH → –COO–.
 Cys: –SH → –S–.
 Tyr: –OH → -O– .

 La cercanía de grupos ácido-base provoca interacciones

que desestabilizan el sustrato para convertirse en producto.
Ej.: catálisis ácido-base:
http://depa.fquim.unam.mx/proteinas/enzcatal/CPAquim.html
Rotura de un enlace peptídico.

Quimotripsina Quimotripsina Quimotripsina

Ser Ser Ser

His: HO HisH O His: HO
:

:
– –
R–N–C–R’
–

δ+
R–N–C–R’ H O– R–NH2
=

H H
–

H O +
–
–

δ– Gly Ser –O
C–R’
O
 Catálisis covalente: Nucleófilos Electrófilos
 Se debe a grupos –O–
O cargado negativamente –C–
:R
nucleófilos-electrófilos:

=O
(ácido carboxílico ionizado)
C de un grupo carbonilo
son átomos inestables con –S– (el O del carbonilo atrae e– del C)
S cargado negativamente
e– de más o de menos. (grupo sulfihdrilo ionizado) :R
+
C=N–

– –

–
–C–
 La cercanía de estos Carbanión
H
Grupo imino protonado
grupos provoca (activado para el ataque

– –
–N: nucleofílico sobre el C por
interacciones que Grupo amino no cargado protonación de la imina)
O
desestabilizan el S para :R

–
O–P=O
HN N:
convertirse en P.

–
O
P de un grupo fosforilo
Imidazol
:R
H–O– H+
Ión hidróxido Protón
Ejemplos de catálisis covalente:
http://depa.fquim.unam.mx/proteinas/enzcatal/liszquim.html
Rotura de un Polisacárido de 6  Sustratos de 2 y 4 unidades.
 Catálisis por iones metálicos.
Ej. Hidrólisis del ATP
 El Mg2+ cambia la polaridad del Pi.
 Desestabiliza al ATP para convertirse en producto.
Base: H–O–(Ser)
:
O– O– O–
– =

– =
– =

–O–P~O–P~O–P–O–CH Adenina
2
O O O H H
H H
Mg2+
OH OH
1. Enzimas: Composición y Clasificación
2. Mecanismo de acción
3. Energía de Activación y Estado de Transición
4. Modelos de funcionamiento
5. Mecanismo de unión y catalítico
6. Uso de las enzimas en Medicina
 A veces tienen componente molecular adicional:
1. Cofactor o Coenzima
HOLOENZIMA
2. Apoenzima (Proteína)

SUSTRATO

APOENZIMA COFACTOR

→
O
COENZIMA
HOLOENZIMA
+ → Enzima + cofactor
(catalíticamente activo)
 CLASE FUNCIÓN SUBCLASES
Deshidrogenasas, Oxidasas
1. Oxidorreductasas Transferencia de electrones
…
Transferencia de grupos Transaldolasas y
2. Transferasas
funcionales Transcetolasas …
3. Hidrolasas Reacciones de hidrólisis Esterasas, Glucosidasas …
Rompen enlaces C–C, C–N o
Descarboxilasas, Aldolasas
4. Liasas C–S, y forma doble enlace en la
…
molécula resultante o viceversa
Transferencia de grupos dentro
5. Isomerasas Racemasas, Epimerasas …
de la molécula
Condensación dependiente de
6. Ligasas
hidrólisis de ATP Sintetasas, Carboxilasas …
 S + E ES EP E + P

Enzima Enzima

UNIÓN A
CENTRO ACTIVO
CATÁLISIS

Molécula S Complejo Complejo Molécula P

(sustrato) Enzima – Enzima – (producto)
Sustrato Producto
(ES) (EP)
 Las enzimas, al disminuir la energía de activación,
aumentan la velocidad de reacción

Estado de
Transición (‡)
Energía libre, G

‡ ΔG‡Sin catalizar
ΔG‡Catalizado
S
P

Coordenada de la
reacción
 El modelo de encaje inducido explica
el mecanismo enzimático
 La alta especificidad E-S
 La complementariedad entre el centro
activo y el estado de transición
 La compensación entre energía de
fijación y energía de activación
¿Cómo consiguen las enzimas rebajar la energía de
activación?
 Compensando mediante la Energía de Fijación.
Sucede al unirse E+S:
 Se alinean grupos que van a reaccionar.
 Se crean interacciones débiles.

 Compensando mediante la Energía de Catálisis.

Sucede al transformar el S en P:
 Se forman cargas inestables transitorias.
 Se forman enlaces covalentes y/o transferencias de grupos entre
E y S.
Ej.: catálisis ácido-base y covalente

Quimotripsina Quimotripsina Quimotripsina

Ser Ser Ser

His: HO HisH O His: HO
Catálisis
:

:
ácido-base – –
R–N–C–R’
–

δ+
R–N–C–R’ H O– R–NH2
=

H H
–

H O Catálisis +
–
–

δ– covalente Gly Ser –O

C–R’
O
1. Enzimopatías.

2. Diagnóstico.

3. Terapéutica.

4. Farmacología.
 Enzimopatías
 Anemia hemolítica por deficiencias
enzimáticas:
▪ Glucosa 6-P deshidrogenasa.
▪ Piruvato quinasa.

 Albinismo
▪ Tirosinasa.
 Enzimopatías:
 Enfermedades del almacenamiento del glucógeno:
▪ Enfermedad de von Gierke: Glucosa 6-fosfatasa.
▪ Enfermedad de Pompe: Glucosidasa 1-4 y 1-6.
▪ Enfermedad de Cori: Enzima desramificadora .

Hepatomegalia
 Porfiria: deficiencia en síntesis de
Hemoglobina (del grupo prostético).
▪ Síntoma exclusivo de una de ellas:
lesiones provocadas por el sol.
https://isabelallende.com/es/words/letter
_to_paula
 Hemofilia: deficiencia en una enzima coagulante.
▪ Síntoma: rotura de microvasculatura en articulaciones.
 Pruebas analíticas:
 Glicemia (Glc en sangre): Glucosa oxidasa.
 Enzimas de escape:
▪ TGO, TGP: Transaminasas: daño hepático.
▪ LDH, CPK: daño celular: tumores o hepatitis.
▪ Lipasa, Amilasa: pancreatitis.

 Marcadores tumorales:
▪ Fosfatasa ácida.
▪ PK-M2.
2. Diagnóstico: Enzimas de escape

 Transaminasas: La presencia de algunas proteínas en

suero marcan una enfermedad porque no deberían estar
en suero.
 Son enzimas que generan nuevos Aa a partir de Aa esenciales:
▪ EC 2.6.1.1, Aspartato aminotransferasa (AST, GOT).
▪ EC 2.6.1.2, Alanina aminotransferasa (ALT, GPT).

COOH COOH COOH COOH

H2N CH + C O C O + H2N CH
R1 R2 R1 R2
 Aspartato aminotransferasa:
EC 2.6.1.1 (AST, GOT)
 En estado sano están en el citosol y mitocondrias de hígado y miocardio.
 Si hay daño en estos tejidos AST y GOT se “escapan” al suero.

COO- COO-
COO- COO- +
+ C O H3N CH
H3N CH C O
+ CH2 + CH2
CH2 CH2
CH2 CH2
COO- COO-
COO- COO-

Aspartato -Cetoglutarato Oxalacetato Glutamato

 Alanina aminotransferasa:
EC 2.6.1.2 (ALT, GPT)

 ALT, GPT en suero

 Se considera casi específica de lesión hepática.

- COO- - COO-
COO COO +
+ C O H3N CH
H3N CH C O
+ CH2 + CH2
CH3 CH3
CH2 CH2
COO- COO-
Alanina Piruvato
-Cetoglutarato Glutamato
Creatin kinasa, EC 2.7.3.2 (CK, CPK)

 Creatin-fosfato es una compuesto rico en energía: fosfágeno.

 Específico de tejido muscular.
 La CK específica de miocardio se “escapa” a la sangre cuando hay
infarto. Es un marcador precoz.

CH3 CH3 O
ATP ADP
N CH2 COOH N CH2 CO O P O-
HN C HN C
NH2 O-
NH2

Creatina Creatin fosfato

 Corrección de enzimopatías:
 Hemofilia: Factores de la coagulación.

 Deficiencias enzimáticas:
 Insuficiencia pancreática: Pancreatina.
 Intolerancia a la lactosa: Lactasa.
 Blancos terapéuticos:
 Inflamación, AINES: Ciclooxigenasas Cox-1 y Cox-2.
 Hipertensión, Captopril: ECA.
 SIDA, Zidovudina: Transcriptasa reversa.
 SIDA, Saquinavir: Proteasas de HIV.
 Trombosis: anticoagulantes, heparina.

 Diseño de fármacos:
 Enfermedad ácido péptica, Omeprazol: H+-ATPasa.
 Inflamación, Rofecoxib: Cox-2.
 Antibióticos, Cefalosporinas: penicilin acilasa.
 Hace 20 años, una muestra de sangre fue recogida en la
escena de un crimen para poder realizar un test de DNA y ser
utilizada como prueba de acusación en el juicio.
 El abogado defensor propone que el test no es fiable ya que
sabe que las reacciones de hidrólisis del DNA tiene una ΔG
negativo.
 Concluye que por ese motivo el DNA se ha degradado
espontáneamente después de todo este tiempo, y que ahora
no sirve.
 Te llaman como testigo experto de la acusación por tus
conocimientos en Bioquímica y debes explicar que no es
correcto. ¿Qué dirías?
 LIBROS Y TEXTOS:
 Baynes (Elsevier)
 Lehningher (Omega)

 IMÁGENES:
 Alberts (Garland Science)
 albinismopr.wordpress.com
 www.uvs.sld.cu
 www.diariomedico.com
 www.disgoo.com
 http://biomanbio.com/GamesandLabs/LifeChemgames/Enzymatic.html