Aislamiento e identificación

de enterobacterias

De

Herrera Vivas Adriana

Yennifer Lizeth Ignacion Leon
Profesor

Blgo. Roger Palomino

 INTRODUCCIÓN

La familia Enterobacteriaceae constituye un grupo grande y heterogéneo de bacterias

gram negativas. Reciben su nombre por la localización habitual como saprofitos en el
tubo digestivo, aunque se trata de gérmenes ubicuos, encontrándose de forma
universal en el suelo, el agua y la vegetación, así como formando parte de la flora
intestinal normal de muchos animales además del hombre.
La mayoría de las especies pueden aislarse del intestino del hombre y de otros
animales, de allí su nombre enterobacteria (del griego entéron), intestino. Pueden ser
flora o ser transitorias en la cavidad bucal, en las regiones húmedas de la piel, en
especial el perineo, las fosas nasales y las vías genitales femeninas.
La familia Enterobacteriaceae incluye a organismos que resultan patógenos para el
ser humano como la Escherichia coli o la Salmonella, especialmente importantes en la
mortalidad infantil en países en desarrollo y patógenos para las plantas como
Erwinia, en la mayor parte de los casos causando infecciones oportunistas. Todos los
bacilos de la familia Enterobacteriaceae son resistentes a antimicrobianos comunes,
tales como la penicilina, la meticilina y la clindamicina,entre otros.

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 MARCO TEÓRICO

La familia Enterobacteriaceae comprende bacilos Gram negativos, anaerobios

facultativos no formadores de espora. Esta familia pertenece a la clase Proteobacteria
y al Orden Enterobacteriales. Las especies dentro de esta familia son generalmente
móviles (excepto: Arsenophonus ,Biostraticola, Klebsiella, Moellerella, Raoultella,
Shimwella, Tatumella y los endosimbiontes), catalasa positivos, oxidasa negativos
(excepto Pleisomonas) y usan la Vía Ebden-Meyerhof para el metabolismo de
azucares y la producción de ácidos a partir de la fermentación de la glucosa. Sin
embargo, la clásica caracterización bioquímica, fisiológica y morfológica que
inicialmente definió a esta familia presentaba limitaciones que han ido resolviéndose
gracias al uso de herramientas moleculares. El DNAr 16S y otras secuencias de genes
han permitido revolucionar nuestro entendimiento de estos microorganismos y las
relaciones existentes entre ellos (Mcclung, 1987). Actualmente, esta familia
comprende 51 géneros y 238 especies.

AISLAMIENTO
Los miembros de Enterobacteriaceae más relevantes desde el punto de vista clínico o
ambientales pueden crecer fácilmente en agar de sangre o chocolate a 35–37 ° C sin
requisitos atmosféricos específicos. Algunos requieren temperaturas más bajas para el
crecimiento. El aislamiento muestras con mix de bacterias puede requerir
enriquecimiento en medios selectivos. Para el aislamiento de Enterobacteriaceae de
productos alimenticios para consumo humano y alimentación de animales, así como de
muestras ambientales en el área de producción y manejo de alimentos, el caldo de
enriquecimiento de Enterobacteriaceae (EE) es un medio recomendado por la norma
ISO 21528-1: 2004. para la detección y enumeración de Enterobacteriaceae por el
método del número más probable.
El caldo EE contiene digestión pancreática de gelatina y glucosa como las fuentes de
nitrógeno y energía, y sales biliares y verde brillante como agentes selectivos, que
inhiben las bacterias grampositivas y la mayoría de las bacterias gramnegativas. Para el
aislamiento de Enterobacteriace de muestras clínicas, se pueden usar tres tipos de
medios, medios no selectivos como agar sangre, medios selectivos / diferenciales como
agar MacConkey y Agar EMB o caldos de enriquecimiento como Caldo de Selenito y
Caldo Gram Negativo. Este último es particularmente útil para la recuperación de
Salmonella y Shigella de muestras de heces. Klebsiella granulomatis es una excepción
que requiere medios especializados para la cultura. Inicialmente se logró cultivarla en
huevos embrionados de pollo, posteriormente en medio sin células y actualmente en
sistema de cocultivo de monocitos (Joosten, Marugg, Stephan, …, & 2008, n.d.;
Mcclung, 1987).

HABITAT
Las enterobacterias son ubicuas en la naturaleza. Muchas especies pueden existir como
vida libre en diversos nichos ecológicos, tanto en ambientes terrestres como acuáticos,
y algunas a menudo se asocian con animales, plantas o insectos. Por conveniencia, los
organismos se clasifican ampliamente en tres tipos: (1) aquellos que pueden causar
infecciones o principalmente asociados con humanos / animales y el medio ambiente,
(2) aquellos que están asociados con plantas o patógenos de plantas y el medio ambiente,
y (3) aquellos que son insectos asociados o endosimbiontes. La demarcación de
patógenos de plantas y humanos no está clara, ya que muy pocos géneros pueden causar

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 infecciones en ambos. Algunas especies de patógenos asociados a plantas (por ejemplo,
Pantoea agglomerans) y patógenos de insectos (por ejemplo, Photorhabdus
luminescens) pueden causar infecciones en humanos como huésped accidental. Algunos
patógenos humanos como Salmonella y E. coli O157: H7 también pueden colonizar o
invadir plantas, y los brotes se han asociado con el consumo de productos vegetales
crudos que pueden ser el resultado de bacterias dentro del tejido vegetal en lugar de en
la superficie (Mcclung, 1987).

PATOGENICIDAD
Las enterobacterias en general se consideran bacterias entéricas que viven en el intestino
de los animales y no causan enfermedades. Sin embargo, las enterobacterias causan una
variedad de enfermedades en humanos, otros animales y plantas, con algunos
géneros/especies que causan enfermedades en ambos, como se mencionó anteriormente.
Se sabe que muchas de estas formas patógenas han surgido varias veces a través de la
adquisición de factores de virulencia que están codificados por islas de patogenicidad,
plásmidos y profagos, y son móviles. La más conocida y mejor estudiada es la E. coli
con múltiples tipos patógenos, incluyendo la E. coli enteropatógena, enterohemorrágica,
enteroinvasiva, agregada y extraintestinal. Cada tipo patógeno ha demostrado tener
múltiples linajes independientes(Croxen, Microbiology, & 2010, n.d.)
A continuación, se enlistan las especies del género con mayor importancia clínica y se
realizaré una breve descripción de algunas de ellas.

 Escherichia
Este género contiene cinco especies: E. albertii, E. coli, E. fergusonii, E.
hermannii y E. vulneris. Las cinco especies son bien conocidas como habitantes
del tracto gastrointestinal humanos y de otros animales. E. coli es el principal
patógeno humano y de otrosx animales causando infecciones intestinales y
extraintestinales, esta bacteria ha desarrollado la capacidad de invadir todos los
tejidos y sistemas del cuerpo. E. coli puede ser distinguida en clases patogénicas
basado en el modo de patogénesis; estas pueden ser: enteropatogenica,
enterohemorrágica, enterotoxigénica, enteroagregativa, enteroinvasiva y
patógeno extraintestinal (EPEC, EHEC, ETEC, EAEC, EIEC y ExPEC)
(Balows, Trüper, Dworkin, & Harder, 2013).

 Klebsiella
El nombre de este género fue dado en honor del bacteriólogo alemán Edwin
Klebs. Las especies de este género presentan cápsula y pueden estar dispuestas
en pares o cadenas cortas, no son móviles. Pueden usar el citrato y la glucosa
como única fuente de carbono. Producen ácido y gases producto de la
fermentación de la glucosa y la mayoría de cepas producen 2,3-butanodiol
como producto final de la fermentación, son catalasa positivos. El género
consta de cinco especies: K. alba, K. granilomatis, K michiganensis, K. oxytoca
y K. pneumoniae (Balows et al., 2013).

 Salmonella
El nombre de este género fue dado en honor del bacteriólogo americano D. E.
Salmon. Comprende microorganismos móviles con flagelos peritricos. Exiten
solo dos especies dentro de este género: S. entérica y S. bongori. Para la
identificación de las especies de este género es necesaria la serotipificación,
existen actualmente mas de 2 400 serovars dentro del género Salmonella los
cuales inicialmente se nombraban usando la nomenclatura binomial (por

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 ejemplo, Salmonella typhimurium) actualmente se usa el prefijo serovar
seguido de la serovariedad (por ejemplo, Salmonella serovar Thyphimurium).
Algunas de estas serovariedades han evolucionado para convertirse patógenos
especializados causando infecciones en humanos. Las fiebres entéricas mas
conocidas son causadas por las serovariedades Typhi, Paratyphi A, Paratyphi
B, Paratyphi C y Sendai.

 Enterobacter
Las especies de este género pueden crecer fácilmente en cualquier medio.
Pueden producir ácido y gas a partir de la fermentación de la glucosa y la
lactosa. La mayoría de las especies son negativas para la prueba de rojo de
metilo y positivas para Voges-Proskauer. Es negativo para la producción de
H2S y fenilalanina desaminasa. El género Enterobacter es grande, con 20
especies: E. aerogenes, E. amnigenus, E. arachidis, E. asburiae, E.
cancerogenus, E. cloacae, E. cowanii, E. gergoviae, E. helveticus, E.
hormaechei, E. kobei, E. ludwigii, E. mori, E. nimipressuralis, E. oryzae, E.
pulveris, E. pyrinus, E. radicincitans, E. soli y E. turicensis.

 Serratia
En 1823, Bizio describió las bacterias pigmentadas en rojo observadas en la
polenta y la llamó Serratia marcescens. Serratia puede crecer en un medio
mínimo sin la adición de factores de crecimiento. El ácido se produce a partir
de maltosa, salicina y trehalosa. ONPG se hidroliza. Actualmente hay 15
especies reconocidas: S. entomophila, S. ficaria, S. fonticola, S. glossinae, S.
grimesii, S. liquefaciens, S. marcescens, S. nematodiphila, S. odorifera, S.
plymuthica, S. proteamaculans , S. quinivorans, S. rubidaea, S. symbiotica, y
S. ureilytica. S. marcescens se divide en dos subespecies subsp. marcescens y
subsp. sakuensis. Serratia se reconoció por primera vez por su pigmento rojo
no difusible, denominado prodigiosina. Sin embargo, la mayoría de las
especies no están pigmentadas. Los que producen pigmento incluyen S.
nematodiphila, ambas subespecies de S. marcescens, S. rubidaea, S.
plymuthica y S. fonticola. Serratia no forman esporas, excepto S. marcescens
subsp. sakuensis. Una especie, S. ureilytica, ha sido descrita como una especie
que disuelve la urea.

 Citrobacter
 Yersinia
 Proteus
 Providencia
 Morganella
 Shigella
 Edwarsiella

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 MATERIALES Y MÉTODO

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importantes en la mortalidad infantil en países en desarrollo y patógenos para las
plantas como Erwinia, en la mayor parte de los casos causando infecciones
oportunistas. Todos los bacilos de la familia Enterobacteriaceae son resistentes a
antimicrobianos comunes, tales como la penicilina, la meticilina y la
clindamicina,entre otros.

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 RESULTADOS

MÉTODO DIRECTO – HECES HUMANA

xld ss

mc emb

MÉTODO INDIRECTO – ENRIQUECIMIENTO PREVIO

XLD SS

MC EMB

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 MÉTODO DIRECTO – POOL BACTERIANO

COLONIAS OBTENIDAS EN AGAR MAC CONKEY DEL TUBO DEL POOL BACTERIANO
COLONIA 1 COLONIA 2 COLONIA 3
MORFOLOGÍA EN PLACA
TINCIÓN GRAM
CATALAS
A

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 Tabla 1: Pruebas presuntivas para el tubo de pool bacteriano

BACTERIAS SELECCIONADAS PARA LAS PRUEBAS BIOQUIMICAS

Colonia A Colonia B
LACTOSA + LACTOSA -
comportamiento cultural

Catalasa

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 Oxidasa

Tabla 2: Pruebas presuntivas para las colonias A Y B obtenidas de agar XLD

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Colonia A Colonia B

TSI

gas H2S Gas H2S

K/A + - A/A +++ -

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 LIA

H2S LISINA H2S LISINA

K/K - + K/K - +

Citrato de
Simmons

SIM

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 MIO

m i o M I O
- + - - + -

ÚREA

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 MR/VP

Tabla 3: Pruebas bioquímicas para las colonias A y B

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En la presente práctica, se puso en ejecución dos métodos para el aislamiento de

enterobacterias: el método directo y el método indirecto con previo enriquecimiento. El
método directo actualmente tiene mucho valor en el ámbito clínico, ya que, frente a la
creciente resistencia a antibióticos, el tratamiento empírico basado en la epidemiologia
de las enfermedades infecciosas va perdiendo valor. Ante esto, este método se presenta
como un protocolo alternativo que permite reportar en 24 horas la identificación y
antibiograma presuntivo para iniciar el tratamiento clínico adecuado, sin embargo los
resultados obtenidos por este método deben ser siempre confirmados con el método
estandarizado (Blácido & Patricia, 2015). En cambio, el método indirecto con previo
enriquecimiento es obligatorio en el análisis de calidad de alimentos según la norma
ISO actual para la detección de Enterobacteriaceae (21528-1: 2004), el objetivo del
enriquecimiento previo es permitir la proliferación de las bacterias entéricas que
generalmente se encuentran en proporciones bajas en las muestras ambientales o
alimentarias, además, que contiene inhibidores de bacterias Gram positivas y otras
bacterias Gram negativas distintas a las bacterias entéricas (Weber, Stephan, Druggan, Field Code Changed
Joosten, & Iversen, 2009). En nuestra experiencia, el medio usado para el

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 enriquecimiento selectivo fue el caldo Rappaport el cual contiene un sistema de buffer
fosfatos, alta concentración de sales de magnesio y sodio y la presencia del colorante
verde de malaquita. Este medio es usado para el enriquecimiento selectivo de especies
de Salmonella spp. debido a su capacidad de sobrevivir y multiplicarse a presiones
osmóticas elevadas (la elevada concentración de Cloruro de Magnesio le otorga esa
capacidad al medio), pH relativamente bajos y porque la elevada concentración de sales
de magnesio reduce el efecto toxico del verde de malaquita (Corry, Curtis, & Baird,
2011). Las principales diferencias en la aplicación de ambos métodos en la practica
radican en la cantidad de microorganismos recuperados (número de colonias) y el
tiempo necesario para obtención de resultados. Siendo el método indirecto el que
permite recuperar mayor numero de microorganismos y el método indirecto el más
rápido.
El aislamiento directo en Agar MacConkey a partir del pool bacteriano nos permitió
recuperar tres tipos de colonias con características morfológicas distintas. Siendo las
tres colonias positivas para le uso de lactosa ya que la producción del ácidos producto
del metabolismo de la lactosa hace que el pH del medio descienda y el indicador vire a
rojo. La tinción Gram de las tres colonias fue negativa y la reacción de la catalasa
positiva.
A partir de los aislamientos de las muestras de heces en Agar XLD, se seleccionaron
dos colonias para las pruebas bioquímicas: una lactosa positiva y una lactosa negativa.
La colonia lactosa positiva era grande, convexa, amarilla y de aspecto mucoide; esto
puede ser sospechoso para el género Klebsiella. La colonia lactosa negativa eran
transparentes pero parecen de color rojo debido al color del medio, planas y brillosas;
esto puede ser sospechoso del género Shiguella o especies del género Salmonella no
productoras de Hidrogeno Sulfurado. Ambas colonias eran catalasa positivas y oxidasa
negativas.
En las pruebas bioquímicas la colonia Lactosa positiva aislada del Agar XLD sólo
fermentó la glucosa en el medio TSI, con producción de gas y sin producción de
Hidrógeno sulfurado, esto va en contra de la fermentación de lactosa observada en el
medio XLD durante el aislamiento primario. La lectura de todos los tubos de las pruebas
bioquímicas se realizó a las 48 horas de inoculados en el medio, se podría pensar en un
falso negativo de la prueba. En la prueba de descarboxilación/desaminación de la Lisina,
se observó que todo el tubo se mantuvo de color morado, es decir, que la
descarboxilación de la Lisina fue positiva ya que el producto de la descarboxilación,
llamado cadaverina, volvió a alcalinizar el tubo que se acidifica debido a la
fermentación de la glucosa del medio. La presencia de la enzima citrato permeasa fue
detectada por la alcalinización del medio, esto debido a que esta enzima produce ácidos
orgánicos a partir del citrato los cuales son utilizados como fuente de carbono
produciendo carbonatos y bicarbonatos luego de su metabolismo, estos carbonatos y
bicarbonatos elevan el pH del medio. La prueba SIM permite detectar la movilidad,
producción de hidrogeno sulfurado y la presencia de la enzima triptofanasa, esto ultimo
gracias a la presencia de la tripteína rica en triptófano que al ser degradado por la enzima
triptofanasa produce indol como resultado. El indol es detectado por el reactivo de
Kovacs formando un anillo rojo en la superficie del medio. La prueba del indol fue
positiva, mientras que las del hidrogeno sulfurado y movilidad negativas. El medio MIO
pone a prueba la movilidad, producción de indol y la presencia de la enzima Ornitina
descarboxilasa; al igual que el medio SIM es rico en tripteína para la detección del indol,
la acción de la enzima Ornitina descarboxilasa se ve favorecida por el pH bajo del medio

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 y actúa sobre la ornitina produciendo putrescina la cual tiene naturaleza básica y
alcaliniza el medio virándolo a purpura. Las reacciones de movilidad y descarboxilación
de la ornitina fueron negativas, mientras que la producción de indol fue positiva. La
producción de enzima ureasa es detectada usando un medio rico en urea como el Agar
Urea, en este medio la ureasa transforma la urea en amonio que es una base débil que
eleva el pH del medio observándose de color rojo/rosado gracias al colorante rojo del
fenol; la reacción fue positiva. La prueba del MR/VP sirve para determinar la ruta
metabólica que sigue la glucosa, esta puede ser la Vía Ácido mixta con productos finales
ácidos (ácido láctico, ácido acético, ácido formico) los cuales se evidencian mediante
la adición del indicador Rojo de Metilo; la prueba de Voges Proskauer siver para
determinar el uso de la Vía Butanodiolica la cual produce productos finales básicos
(acetil metil carbinol) el cual es detectado mediante la adición de dos reactivos alfa-
naftol e hidróxido de potasio. En el caso de la prueba realizada, se determinó el uso de
la Vía Ácido Mixta mediante el reactivo rojo de metilo.
La colonia lactosa negativa fermentó tanto la glucosa como lactosa en el medio TSI con
mayor producción de gas que la anterior y sin producción de Hidrógeno Sulfurado. En
la prueba de descarboxilación/desaminación de la Lisina, se observó que todo el tubo
se mantuvo de color morado, es decir, que la descarboxilación de la Lisina fue positiva
ya que el producto de la descarboxilación, llamado cadaverina, volvió a alcalinizar el
tubo que se acidifica debido a la fermentación de la glucosa del medio. No se observó
variación en el indicador de la prueba del Citrato, es decir, no posee la enzima citrato
permeasa. La prueba del indol fue positiva, mientras que las del hidrogeno sulfurado y
movilidad negativas. En el medio MIO, las reacciones de movilidad y descarboxilación
de la ornitina fueron negativas, mientras que la producción de indol fue positiva. En el
Agar urea no se observó un cambio de coloración en el medio, por lo tanto, la bacteria
no es capaz de usar la urea debido a la ausencia de enzima ureasa. En la prueba de
MR/VP ambas reacciones fueron negativas.
El uso de azucares, específicamente la lactosa, de las colonias aisladas muestra
ambigüedades con respecto al comportamiento cultural presentado al momento de su
aislamiento. Esto puede ser debido a que las pruebas bioquímicas se realizaron a partir
de colonias en placa, se escogió la colonia mejor asilada para iniciar las pruebas, al
agotarse una colonia, se procedió a usar otra de comportamiento cultural similar, sin
embargo, esto puede traer consigo un error de contaminación ya que esta segunda no se
encontraba tan aislada como la primera y un mal manejo debido a la inexperiencia del
manipulador puede traer consigo el arrastre de otra colonia. En el caso de la colonia Lac
positiva la bioquímica no nos permite determinar a qué organismo pertenece, debido a
las ambigüedades presentes en las reacciones. En cambio, la colonia Lactosa negativa
se pudo identificar como una posible integrante del género Klebsiella, siendo mas
exactos, K. oxytoca.

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 CONCLUSIONES
- Se logró aislar microorganismos de la famiania Enterobacteriaceae mediante
los métodos directo e indirecto.
- El método indirecto permite la recuperación de un mayor número de
microorganismos entéricos ya que se realizar un pre enriquecimiento selectivo.
- El método directo permite una recuperación rápida de los microorganismos.
- Las pruebas bioquímicas deben ser realizadas a partir de cultivo puro en caldo
para evitar el agotamiento de la cepa en el momento de la siembra.

BIBLIOGRAFÍA

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45–0025. https://doi.org/10.5860/choice.45-0025
Blácido, S., & Patricia, Z. (2015). Evaluación del método directo para la
identificación y antibiograma de Enterobacterias en Urocultivo de pacientes con
bacteriuria significativa atendidos en el. Retrieved from
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Corry, J., Curtis, G., & Baird, R. (2011). Handbook of culture media for food and
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Mcclung, L. S. (1987). Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Volume 2.:
Edited by Peter H. A. Sneath with Nicholas S. Mair and M. Elisabeth Sharpe.
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Weber, C., Stephan, R., Druggan, P., Joosten, H., & Iversen, C. (2009). Improving the
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