Técnicas Histológicas Dra. Cecilia Valladares N.

cecilia.valladares@udla.
edu.ec
TÉCNICAS UTILIZADAS EN
HISTOLOGÍA

Histoquímica y Inmunoquímica y
Autorradiografía,
citoquímica, técnicas de hibridación,

Separación de células y
Microscopios y técnicas
Cultivo de tejido y orgánulos por
microscópicas
órganos, centrifugación
especializadas.
diferencial,
 Tinción con hematoxilina y eosina con fijación en formalina.

El corte de rutina teñido con hematoxilina y eosina es la muestra

que se utiliza con mayor frecuencia.

PREPARACIÓN DEL TEJIDO

 El primer paso en la
preparación de una muestra
de tejido
u órgano es la fijación para
conservar la estructura.
• LA FIJACIÓN, obtenida en general mediante una
sustancia química o una mezcla de sustancias químicas,
conserva de forma permanente la estructura del tejido
para tratamientos posteriores.
FIJACIÓN Abolir el metabolismo celular

Impedir la degradación enzimática

de las células y tejidos por la
autólisis

Destruir microorganismos patógenos

tales como bacterias, hongos o virus

Endurecer el tejido como resultado

de la formación de enlaces cruzados
 • El formaldehído conserva la • Dado que no reacciona con
• Una solución acuosa de estructura general de la los lípidos, es un mal fijador
formaldehído al 37 % célula y de los componentes de las membranas celulares
extracelulares al reaccionar
con los grupos amino de las
proteínas

Formalina
 En el segundo paso, la • Para examinar una muestra se requiere de su infiltración
muestra se dispone para su con un medio de inclusión que permita realizar corte
inclusión muy delgados, por lo general en el rango de 5 um a 15
en parafina con el fin de um
permitir su corte.
• Después de la fijación la muestra se LAVA y se
DESHIDRATA en una serie de soluciones
alcohólicas de concentración creciente hasta
alcanzar alcohol al 100%.

• En el paso siguiente, el ACLARADO, se utilizan

solventes orgánicos tales como el XILENO o
TOLUENO que son miscibles tanto en alcohol
como en parafinas, para extraer el alcohol
antes de la infiltración de la muestra con la
parafina fundida.
• Cuando la PARAFINA fundida se ha enfriado y
endurecido, se empareja para formar un bloque de
tamaño adecuado.

• Este bloque se coloca en una máquina cortadora

especial, el MICRÓTOMO que lo corta en
rebanadas finas con una cuchilla de acero.

• Los cortes obtenidos se montan sobre

portaobjetos de vidrio utilizando un medio de
montaje (pineno o resinas de acrílico) como
adhesivo.
 • Debido a que los cortes en parafina son incoloros, la
muestra todavía no está lista para su examen bajo el
microscopio óptico.
En el tercer paso, la
muestra se tiñe para • La HEMATOXILINA y la EOSINA se utilizan
principalmente para poner en evidencia las
permitir su examen. características estructurales
HISTOQUÍMICA Y
CITOQUÍMICA
• Los procedimientos
HISTOQUÍMICOS y
CITOQUÍMICOS pueden tener su
fundamento en la unión específica
de un colorante, en el uso de
anticuerpos marcados con un
colorante fluorescente con un
componente celular en particular
o en la actividad enzimática
inherente de un elemento
constitutivo de la célula.
• Los siguientes son ejemplos de complejos
macromoleculares grandes:
La composición
- Nucleoproteínas química de un
tejido listo para
- Proteínas intracelulares del citoesqueleto
una tinción
- Proteínas extracelulares de rutina
- Complejos de fosfolípidos y proteínas (o
difiere de la del
hidratos de carbono) en las membranas. tejido vivo.
 Muchos de los A pesar de que los ácidos Las proteínas pequeñas y
componentes de los nucleicos, proteínas y los ácidos nucleicos
tejidos se pierden durante fosfolípidos en su mayoría pequeños, como los ARN
la preparación de rutina de se conservan en los cortes de transferencia, en
los cortes teñidos con de tejidos, también generalse pierden durante
H&E. muchos se pierden. la preparación del tejido.
Colorantes ácidos y Básico: carga neta positiva ¿QUE TIÑEN? heterocromatina y componentes • materiales
básicos y reaccionan con los nucléolos del núcleo citoplasmáticos como el extracelulares como los
componentes aniónicos de (grupos fosfatos) ergastoplasma(grupos hidratos de carbono
la célula (los que tienen fosfato del ARNr) complejos de la matriz del
carga neta negativa) como cartílago (grupos sulfato ).
los grupos fosfato de los
ácidos nucleicos, los
carboxilo de las proteínas
y sulfato de los
glucosaminoglucanos . la
capacidad de reaccionar
con los componentes
aniónicos se llama
BASOFILIA

Fundamentos químicos de la tinción

COLORANTES ÁCIDOS Y ACIDO: CARGA NETA ¿QUÉ TIÑEN? FILAMENTOS COMPONENTES FIBRAS EXTRACELULARES
BÁSICOS NEGATIVA (EOSINA) Y CITOPLASMÁTICOS, EN MEMBRANOSOS
REACCIONAN CON LOS ESPECIAL LOS DE LAS INTRACELULARES Y
GRUPOS CATIÓNICOS EN CÉLULAS MUSCULARES CITOPLASMA NO
LAS CÉLULAS Y LOS ESPECIALIZADO, Y
TEJIDOS ( CON CARGA
POSITIVA) COMO LOS
GRUPOS AMINO
IONIZADOS DE LAS
PROTEÍNAS. LA
CAPACIDAD DE
REACCIONAR A UN
COMPONTE CATIÓNICO SE
LLAMA ACIDOFILIA

Fundamentos químicos de la tinción

OVARIO
Folículo
Tinción: H.E primordial
Dx: órgano macizo, coloración de rutina
OVARIO
Tinción: H.E
Dx: órgano macizo, coloración de rutina

Folículo en
crecimiento
(oocito primario)
OVARIO
Tinción: H.E.
Dx: órgano macizo, coloración de rutina.

Núcleo
Nucleolo

Citoplasma
 Capacidad de ciertos
colorantes básicos que
reaccionan con los
componentes del tejido que
cambian su color normal de
azul a rojo o púrpura

DERIVADOS TIAZÍNICOS AZUL

DE TOLUIDINA Y TIONINA.

Metacromasia
Después de la tinción: la muestra se
pasa por XILENO O TOLUENO y se le
coloca un medio de montaje no
acuoso antes de cubrirla con un
CUBREOBJETOS para obtener un
preparado permanente.
 Inclusión en
Corte –
Fijación Deshidratación Aclarado parafina ---
micrótomo
taco

Se coloca en Tinción
Aclarado Rehidratación Deshidratación
portaobjetos hematoxilina

Tinción con Colocación de

Aclarado
eosina cubreobjetos
 Fijación: glutaraldeido y tetraoxido de osmio

Preparación Deshidratación
de tejidos
para Inclusión: resinas epoxi y distintos materiales plásticos

microscopia No precisa eliminarse el plástico de la inclusión

electrónica Corte con ultramicrotomo (20-100 nm)

inmersión breve de la grilla en una solución de acetato

de uranilo o acetato de plomo
 Aprovechan las acciones físicas y químicas sobre
los preparados histológicos para determinar la
localización de sustancias químicas en las células
y los tejidos
HISTOQUÍMICA
Y CITOQUÍMICA Los procedimientos histoquímicos y citoquímicos
pueden tener su fundamento, en el uso de
anticuerpos marcados con un colorante insoluble
fluorescente con un componente celular en
particular o en la actividad enzimática inherente
de un elemento constitutivo de la célula
 Determina localización de
elementos celulares

Evitar el xileno que disuelve los

HISTOQUÍMICA
Y CITOQUÍMICA lípidos

Se emplea tanto en la microscopia

óptica como electrónica.
HISTOQUIMICA ENZIMATICA

Se utilizan para identificar y localizar enzimas en células y tejidos

SE EMPLEA UNA FIJACION ALDEHIDICA LEVE PARA PRESERVAR LA ACTIVIDAD

ENZIMATICA

Se detecta el producto de reacción de la actividad enzimática y no la enzima

propiamente dicha. En general, se usa un reactivo de captura, ya sea un colorante o
un metal pesado, para atrapar o fijar el producto de reacción de la enzima
INMUNOHISTOQUIMICA
Los anticuerpos
Los anticuerpos se purifican Y
(inmunoglobulinas), son
SE BASA EN LA especificidad de la CONJUGAN CON UN COLORANTE
glucoproteínas que se producen
reacción entre antígeno y FLUORESCENTE (FLUOROCEINA :
por las células específicas del
anticuerpo ABSORBE LUZ UV Y EMITE LUZ
sistema inmunitario en respuesta a
VERDE)
una proteína extraña o antígeno.

EMPLEA ANTICUERPOS También es posible conjugar

LA MUESTRA SE EXAMINA EN UN
POLICLONALES Y MOCLONALES anticuerpos policlonales o
microscopio de fluorescencia o un
(CELULAS DE MIELOMA: monoclonales con otras sustancias,
microscopio confocal
HIBRIDOMAS) como enzimas
Directa: Ac primario+ fluorocromo en
contacto con Ag

Indirecta : Ac secundario + fluorocromo

en contacto con Ac primario
TECNICAS DE HIBRIDACION
método de localización de ARNm o ADN mediante la hibridación (capacidad
de interactuar con una secuencia complementaria ) de la secuencia de
interés con una sonda de nucleótidos de secuencia complementaria

En la hibridación in situ, la localización del ARNm o ADN específico (se

realiza directamente dentro de las células o tejidos, adicionando la sonda
de nucléotidos marcada radiactivamente.

Las sondas radioactivas se pueden detectar y visualizar mediante la

autorradiografía

EN CASO DE cantidad muy pequeña de ARNm, puede utilizarse la

amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el
ADN o la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para el ARN.
 AUTORADIOGRAFIA

La autorradiografía utiliza una emulsión

fotográfica que se coloca sobre un corte
histológico para localizar material radiactivo en
los tejidos.

Emulsión expuesta se revela con las

técnicas fotográficas comunes
 La H&E, no siempre permite ver de forma
Otras adecuada ciertos componentes estructurales de
los cortes histológicos tales como elastina, fibras
tinciones reticulares, membranas basales y lípidos
Fucsina- resorcina

Fibras elásticas
 EPIGLOTIS
Tinción: Fucsina resorcina
Dx: fibras elásticas , glándulas mucosas
PAS (acido periódico + reactivo schiff):
capacidad de la fucsina básica
decolorada (reactivo de schiff) para
reaccionar con los grupos aldehído
trae como resultado la aparición de
un color rojo.

Detecta carbohidratos, glicoproteínas,

glucogeno, membranas basales
 • Tinción: PAS
• Dx: órgano macizo, membrana
basal (ricas en hidratos de carbono),
túbulos y glomérulo renal

RIÑON
Carmín de best:

Inclusiones citoplasmáticas-
glucógeno
HIGADO
Tinción: Carmìn de Best
Dx: órgano macizo, células organizadas en hileras, inclusión citoplasmática
(Glucógeno)
HIGADO
Tinción: Carmìn de Best
Dx: órgano macizo, células organizadas en hileras, inclusión citoplasmática (Glucógeno)

Trabèculas
hepáticas
HIGADO
Tinción: Carmìn de Best
Dx: órgano macizo, células organizadas en hileras, inclusión citoplasmática (Glucógeno)

Glucógeno
Capsula de un órgano

• MALLORY:
Se utilizan tres colorantes
ácidos: anilina azul, fuscina
ácida y naranja G: tiñen el
colágeno, citoplasma y
eritrocitos respectivamente

Tinción: Mallory
Dx: fibras de colágeno del tejido conectivo, vasos sanguíneos.
 Sales de plata:
Aparato de Golgi
GANGLIO RAQUìDEO
Tincion: Nitrato de plata
Dx: órgano macizo, neuronas Pseudomonopolares, organela (APARATO DE GOLGI)

Células
Ganglionares
GANGLIO RAQUìDEO
Tincion: Nitrato de plata
Dx: órgano macizo, neuronas Pseudomonopolares, organela (APARATO DE GOLGI)

Aparato de
Golgi
 Orceína y impregnación argéntica
: fibras reticulares y las
membranas basales

Otras Sudan III: grasas neutras

tinciones

ROJO CONGO: identifica proteína

amiloide de color verde manzana
(m. de luz polarizada)