TEMA 7: INMUNOHISTOQUÍMICA

1. CONCEPTO

Los métodos inmunohistoquímicos sirven para detectar antígenos celulares o tisulares

mediante reacciones antígeno-anticuerpo. Para visualizar el lugar donde ocurre la reacción
antígeno-anticuerpo es preciso emplear un trazador o marcador. El marcaje puede realizarse
con fluorocromos y tenemos la técnica de inmunofluorescencia; o puede marcarse con
enzimas y tenemos las técnicas inmunoenzimáticas; o con iones metálicos en forma coloidal y
tenemos las técnicas de inmunooro o isótopo radiactivo.

2. INMUNOFLUORESCENCIA
• FUNDAMENTO DE LAS TÉCNICAS

Las técnicas de inmunofluorescencia fueron introducidas por Coons y colaboradores en 1941,

y desde entonces se han utilizado profunsamente tanto para el diagnóstico clínico como en
investigaciones básicas.

La fluorescencia es una forma de luminiscencia entendiéndose esta última como la emisión de

luz que se produce a partir de una fuente de energía no térmica.

La fluorescencia primaria o autofluorescencia es aquellas que presentan determinadas

sustancias de forma espontánea sin necesidad de ser modificadas, por ejemplo, la lámina
elástica de las arterias muestra autofluorescencia en determinadas circunstancias.

En los tejidos que no presentan esta propiedad se puede inducir fluorescencia, y hablamos de
fluorescencia secundaria. Se realiza mediante tinción histoquímica con moléculas
fluorescentes denominadas fluorocromo, o uniendo fluorocromos a anticuerpos dirigidos
contra antígenos tisulares. De este último procedimiento se sirven las técnicas de
inmunofluorescencia.

• FLUOROCROMOS

Son sustancias químicas que tienen la propiedad de absorber fotones de alta energía
procedente de la luz ultravioleta o del espectro visible, que se excitan y pasan a niveles más
altos, pero son inestables y vuelven a su estado original liberando energía en forma de
radiación luminosa.

Los fluorocromos más utilizados en las técnicas de inmunofluorescencia son la fluoresceína y

la rodamina.

➢ La fluoresceína emite fluorescencia verde manzana.

➢ La rodamina emite fluorescencia rojo anaranjado.
Un fluorocromo se considera óptimo para las técnicas de inmunofluorescencia si reúne las
siguientes condiciones:

- Mínima interferencia en la reacción antígeno-anticuerpo.

- Máxima estabilidad para las condiciones de almacenamiento.
- Máximo de emisión comprendido dentro del espectro de luz visible.
- Disponibilidad sencilla en su forma purificada.
- La longitud de onda de la luz excitadora de la fluorescencia y la de la luz emitida por el
fluorocromo deben estar lo suficientemente distantes como para que puedan
diferenciarse fácilmente.
- El fluorocromo debe descomponerse lo menos posible con la exposición a la luz.
- Aunque no existe el fluorocromo perfecto, el isotiocianato de fluoresceína es la
molécula que reúne las mayores ventajas como tal.
- Los fluorocromos pueden unirse de forma covalente a los anticuerpos, sin alterar la
capacidad de estos últimos para unirse a sus correspondientes antígenos.
- Los anticuerpos marcados con el fluorocromo se obtienen en las casas comerciales.

• TIPOS DE TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA

Las técnicas de inmunofluorescencia se realizan casi siempre sobre tejido congelado porque el
procedimiento de fijación en formol e inclusión en parafina presenta numerosos
inconvenientes para el desarrollo de estos métodos.

Técnica de la inmunofluorescencia directa: se utiliza un anticuerpo específico frente al

antígeno que se desea detectar conjugado a un fluorocromo. FOTO
Técnica de inmunofluorescendia indirecta: se emplea en un primer paso el anticuerpo
específico no marcado, que reacciona con un antígeno; y en una segunda fase, un
anticuerpo marcado con el correspondiente fluorocromo, que reacciona de forma
específica con el anticuerpo primario. La técnica indirecta ofrece algunas ventajas en
relación con la directa, es más sensible y resulta muy útil para detectar en el suero de
pacientes determinados tipos de anticuerpos. FOTO

Otros procedimientos de inmunofluorescencia que son menos utilizados son:

- Técnica de sándwich. Se emplea para detectar la presencia de inmunoglobulinas

específicas frente a un determinado antígeno en las células plasmáticas de tejidos
pertenecientes a un animal previamente inmunizado con este antígeno. FOTO
- Técnica de incubación con complementos. Es una modificación de la técnica
indirecta, y en ella el anticuerpo que se emplea en el primer paso de la técnica ha de
ser capaz de fijar el complemento. Una vez realizada la primera incubación con dicho
anticuerpo, que a su vez es específico frente a un determinado antígeno. Se añade
suero fresco de cobaya como fuente de complemento y se incuba a 37ºC. En una
tercera fase, se incuba con un anticuerpo específico frente a una determinada fracción
de complemento marcada con el fluorocromo.
Por último, usamos un anticuerpo que es un anti-complemento marcado con
fluoresceína. Este método permite detectar tanto antígeno como anticuerpos
desconocidos. FOTO
 • APLICACIONES CLÍNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA

Estas técnicas tienen un campo muy amplio. Se utilizan en muestras líquidas, como el suero o
LCR para cuantificar antígenos y anticuerpos. Estos métodos exigen unos aparatos muy
especiales: espectrofluorometros, capaces de detectar con exactitud la señal emitida por la
muestra.

También se utilizan en cortes de tejidos y cultivos celulares. Aquí podemos detectar y localizar
anticuerpos, antígenos, reacción antígeno-anticuerpo y complementos.

Permite el diagnóstico rápido de infecciones microbianas al localizar el agente causal en un

determinado tejido. Pero en estas técnicas histoquímicas se necesita un microscopio de
fluorescencia para realizar el análisis de los resultados.

La muestra exige una preparación especial, ya que hay que evitar la inactivación del antígeno.
Para ello, los tejidos de biopsias deben congelarse inmediatamente en nitrógeno líquido y
conservarse a -70ºC. Posteriormente se cortan en el criostato y se colocan en portas para
proceder a su tinción.

Otras de las aplicaciones de inmunofluorescencia indirecta

Se utilizan para detectar auto-anticuerpos en el suero de pacientes con enfermedades

autoinmunes. Es útil para la fabricación de un bloque que contengan los distintos tejidos,
porque ello permite detectar diferentes anticuerpos de forma simultánea con una única
muestra de suero.

Los tejidos recomendados para determinar los anticuerpos más usuales son:

- Ac antinucleares ANA: son de hígado y riñón de rata.

- Ac antimicondriales AMA: de riñón y estómago de rata.
- Ac antineutrófilos ANCA: granulocitos humanos.
- Ac antimicrosomiales frente a hígado y riñón: para hígado y riñón de rata.
- Ac antinúcleo liso SMA: de riñón y estómago de rata.
- Ac antimicrosomas tiroideos: tejido tiroideo humano.
- Ac antimúsculo estriado: de esófago de rata.

Procedimiento

- Diluimos en PBS (Buffer de fosfato salino) el suero que vamos a probar. Normalmente
para auto-anticuerpos se emplea una dilución al 1/10. En cambio, para anticuerpos
islotes de Langerhans y glándula adrenal se emplea el suero sin diluir.
- Incubamos las secciones de tejidos elegidas, con el suero problema, durante unos 30
minutos (se puede hacer durante toda la noche a 4ºC) y a temperatura ambiente
(siempre que no sea elevada).
- Se realizan 3 lavados de PBS de 3 minutos cada uno.
- Drenar el exceso de PBS.
 - Incubamos con el conjugado de inmunoglobulina anti-inmunoglobulina humana y
flurocromo a la dilución óptima durante 30 minutos, en cámara húmeda y sin luz. Se
puede usar un suero polivalente frente a todas las inmunoglobulinas.
- Decanta el antisuero y realizar 3 lavados de PBS durante 10 minutos cada uno.
- Montamos en medio hidrosoluble específico para inmunofluorescencia.

Resultados → depende del marcaje utilizado.

Métodos de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica para el estudio del tejido renal

En la biopsia renal es donde primero se aplican técnicas como la inmunofluorescencia y la

microscopía electrónica. Para la localización intrarenal de los inmunocomplejos se utilizan
métodos de inmunofluorescencia específica que permiten estudiar su composición específica.

La utilización de microscopía electrónica es muy útil para localizar los depósitos de electrón
denso de inmunocomplejos dentro del espesor de la membrana de filtración.

Normas generales para la realización de biopsias renales.

Cuando existe enfermedad difusa bilateral, hay 2 formas de realizar la biopsia:

- Por punción percutánea.

- Por biopsia quirúrgica con microlumbotomía.

a. La muestra obtenida se consigue por punción con una aguja percutánea bajo control
ecográfico o radiológico. Con esta punción se obtienen cilindros grandes.

Inconvenientes: hematomas por la punción, hemorragias capsulares o las roturas renales.

Debido a estas complicaciones se utilizan agujas de menor calibre, de 1 a 3 mm de diámetro

con dispositivo de aspiración. Esta aguja consigue un cilindro de 1,2 y 1,4 de grosor y una
longitud de 9-12 mm. No provoca traumatismos renales severos. Su inconveniente reside
cuando su aspiración es excesiva y el cilindro presenta poco glomérulo. Para el diagnóstico es
necesario al menos 2 cilindros independientes.

Las biopsias están indicadas en niños o personas obesas, y este tipo de muestra presenta la
ventaja de que siempre contienen material cortical suficiente para realizar el diagnóstico.

Obtenida la muestra se debe comprobar que contienen glomérulos visibles de la zona cortical.
Estos glomérulos se reconocen con lupa como estructuras globulosas de 1 mm de diámetro.

Una vez obtenida la muestra se envuelve en una gasa con suero fisiológico a 4ºC, y se coloca
en un contenedor con hielo. Si va a transcurrir más tiempo porque se traslado a otro hospital,
se colocan los fragmentos que se van a utilizar para microscopía electrónica en solución
Sucrosa al 6,8% en tampón fosfato a PH 7,2 o directamente en el fijador recomendado.

El material para inmunofluorescencia se conserva en la solución de Michel.

• MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
 3. TÉCNICAS INMUNOENZIMÁTICAS

Son técnicas de inmunolocalización que utilizan una enzima como trazador del marcaje. Por
este motivo, el lugar de la reacción Ag-Ac se visualizan añadiendo al final de la reacción el
sustrato de la enzima más una sustancia denominada cromógeno; y el producto originado al
actuar una enzima sobre el sustrato interacciona a su vez sobre el cromógeno y da lugar a un
precipitado insoluble y coloreado, al igual que ocurre en todas las reacciones
histoenzimológicas. FOTO

Las enzimas más utilizadas:

- La fosfatasa alcalina.
- La peroxidasa.

Los sustratos más utilizados son:

- Diaminobencidina de color pardo.

- Aminoetilcarbozol de color rojo.
- Nitroazul de tetrazolio de color azul.

Estos marcadores pueden conjugarse directamente con el Ac primario, o bien indirectamente

mediante otros Ac secundarios o sustancias como biotina o proteína A.

ANTICUERPO ANTÍGENO DETECTADO

CD1a Células de Langerhans
CD4 Linfocito T de auxilio
CD8 Linfocito T citotóxico
CD30 Células de Reed-stenberg
CD45 Leucocitos
CD68 Macrófagos
S100 Células de Schwann
HMB-45 Melanocitos
AE1 Citoqueratinas de bajo peso
molecular
AE3 Citoqueratinas de alto peso
molecular
DESMINA Células musculares
GFAP Células de Glía
CEA Antígeno carcino-
embrionario
AFP Alfa-fetoproteína
REN Receptores nucleares de
estrógenos

Las técnicas inmunohistoquímicas enzimáticas permiten una localización precisa, siendo su

tinción permanente, estable, y pudiéndose contrastar y evaluar con microscopio de luz. Este
material se conserva durante años sin perder la intensidad de la reacción. Los Ac monoclonales
han permitido aumentar la especificidad y sensibilidad de esta técnica.
Los inconvenientes de esta técnica son:

- La presencia de reacción inespecífica, sobre todo cuando se utilizan Ac policlonales.

- Utilización de reactivos carcinógenos.

Encontramos diferentes técnicas que depende de:

- El Ac a utilizar: monoclonal o policlonal.

- Material disponible: que sea fresco o que esté fijado en formalina.
- Ag a estudiar: que sea de superficie o membrana citoplasmática o nuclear.

• TÉCNICAS DE INMUNOPEROXIDASA

La enzima peroxidasa obtenida del rábano picante es el trazador enzimático más utilizado.
Pueden emplearse en técnicas con Ac marcados que pueden ser directa o indirecta, o con Ac
sin marcar es la técnica de la peroxidasa/antiperoxidasa.

Técnicas de Ac marcados
En este tipo de método, el trazador va unido covalentemente al Ac, pudiendo procederse
durante los métodos directos e indirectos, similares a los fundamentos utilizados en la
inmunofluorescencia.

δ Método directo → es el procedimiento más sencillo, pero también el menos sensible

para la detección de Ac. En él, el Ac o antisuero primario se conjuga directamente con
la enzima peroxidasa.
El método presenta las siguientes dificultades:
- Puede ser difícil conseguir la conjugación entre el Ac y el trazador.
- Durante el procedimiento de conjugación puede destruirse en parte la actividad del
Ac, la actividad de la enzima o la de ambas.
- Es posible que se produzcan una mezcla de Ac conjugados y no conjugados de manera
que sea casi imposible purificar los primeros.
δ Método indirecto → en este procedimiento el Ac primario o específico sin conjugar se
une en un primer paso con el Ag presente en la sección del tejido. En la segunda fase
se añaden un Ac marcado con el trazador enzimático obtenida de un animal distinto
del primario y específico para el animal y la clase de inmunoglobulina que constituyen
el Ac primario. Este Ac recibe la denominación de Ac secundario, y el complejo así
formado puede visualizarse incubando el corte de tejido con un sustrato cromógeno
adecuado.
En resumen, para la técnica de la peroxidasa indirecta se utilizan dos Ac:
1. Un primero sin marcar
2. Uno secundario dirigido frente al primario con peroxidasa y obtenido de diferente
animal.
El método indirecto posee las siguientes ventajas:
▪ Es más sensible que la técnica directa
▪ El antisuero secundario puede utilizarse para todos los antisueros primarios
posibles obtenidos de una misma especie.
Conviene destacar dos características de los métodos directo e indirecto:

 En los dos existe una sola molécula de peroxidasa por cada una de Ac, es decir, se trata
de métodos estequiométricos, puesto que los dos reactivos están en proporción 1/1
(por un Ac hay una molécula de peroxidasa).
 Debido a que cada molécula de peroxidasa es capaz de desdoblar múltiples moléculas
de sustrato, la sensibilidad de ambos métodos es superior a la inmunofluorescencia.

Por otra parte, los métodos de marcaje con peroxidasa encierran dos inconvenientes:

▪ En los tejidos existe normalmente peroxidasa endógena (puede dar lugar a falsos
positivos). Por esta razón, como fase previa a la realización de la técnica, es necesario
inhibir la actividad endógena de dicha enzima sobre el tejido objeto de estudio.
▪ La gran toxicidad que como agente cromógeno posee la diamino-bencidina, utilizada
para revelar la reacción. Esto hace que deba ser manejada con muchísima precaución.

Técnicas de Ac no marcados.
δ Método peroxidasa/antiperoxidasa : Este procedimiento utiliza como trazador
inmunocomplejos formados por la enzima peroxidasa y anticuerpos específicos frente
a ella, en lugar de anticuerpos marcados. FOTO
La peroxidasa se obtiene del rábano picante mediante un proceso de purificación, y se
inocula a un animal para obtener los Ac contra la enzima.
De este modo, al poner en contacto in vitro los Ac con la peroxidasa, se obtienen Ag –
Ac (complejo peroxidasa/antiperoxidasa o PAP) a través de una reacción de
precipitación.
Para este procedimiento de inmunotinción se utilizan sucesivamente 3 reactivos
inmunes diferentes:
1. Ac primario semejante a los empleados para los métodos de inmunoperoxidasa
directa e indirecta.
2. Un Ac puente o secundario , que unirá el Ac 1º al complejo PAP. El Ac puente se
aplica en exceso de tal forma que uno de los dos lugares posibles de unión se una
al Ac 1º, y el otro quede libre para fijarse al complejo PAP.
3. Complejo PAP.

Este procedimiento de inmunolocalización es de 100-1000 veces más eficaz que los

métodos indirectos, que emplean Ac marcados con fluorocromos o peroxidasa.

Con respecto al procedimiento PAP es importante tener en cuenta:

- Que el Ac 1º se obtendrá siempre del mismo animal (generalmente conejo o ratón)

que el complejo PAP, ya que ambos deben quedar ligados por el Ac puente.
- Que el Ac puente o 2º ha de ser de cabra o cerdo cuando el 1º es de conejo.
- Cuando la triple reacción inmune se ha completado, se procede al revelado de la
peroxidasa mediante el agua oxigenada o la diamino-bencidina o cualquier otro
cromógeno.
 - El revelado es el procedimiento histoquímico por el cual se visualizan los lugares de
reacción Ag-Ac. Se realiza añadiendo el sustrato natural de la peroxidasa, en este caso
el H202 más una sustancia denominada cromógeno. Cuando la peroxidasa actúa con
el sustrato, libera oxígeno, que hace que el cromógeno se oxide para originar un
producto de color pardo insoluble. FOTO

Las ventajas más relevantes del complejo PAP son:

1. Con él, pueden demostrarse Ag sin necesidad de marcar los Ac empleados para el
procedimiento inmune, de forma que se evita la manipulación y la consiguiente
pérdida de actividad.
2. Por cada molécula de Ac 1º ligada al Ag, existen al menos 3 de peroxidasa en el
complejo final, lo cual incrementa considerablemente la sensibilidad de la técnica.

• TÉCNICAS DE FOSFATASA ALCALINA Y GLUCOSA OXIDASA

Esta enzima es más difícil de usar que la peroxidasa. El revelado de la enzima se realiza con
esteres de Naftol-AS-fosfato como sustrato, y sales del diazonio como agentes de copulación,
obteniéndose como resultado un colorante azoico rojo o azul.

El inconveniente de esta técnica es que necesita de un medio de montaje acuoso. Su ventaja

reside en que hay muy pocos tejidos con fosfatasa alcalina endógena.

Las técnicas que utilizan la fosfatasa alcalina como trazador pueden usar Ac marcados (directo
o indirecto) o Ac no marcados (técnica de fosfatasa alcalina/anti fosfatasa alcalina).

• MÉTODO DE AVIDINA-BIOTINA

Esta técnica está basada en la fuerza existente entre las moléculas de biotina y las de avidina.

Estas técnicas pueden ser Ac o enzimas y sobretodo la biotina, ya que es una vitamina de
pequeño tamaño. Se puede marcar con biotina el Ac primario (método directo) o el Ac
secundario (método indirecto).

En todas las variantes que existen se pueden unir numerosas moléculas de biotina a un solo
Ac, lo que facilita una alta sensibilidad y permite el uso de Ac primario muy diluido.

• TÉCNICA DE HAPTENO-ANTIAPTENO
• TÉCNICA DEL ORO COLOIDAL Y ORO COLOIDAL PLATA
4. ASPECTOS PRÁCTICOS DEL DESARROLLO DE LAS TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS

Durante las inmunotinciones es conveniente aplicar alguna forma de fijación para preservar el
tejido, aun cuando se manejen secciones en congelación.

Las condiciones en que se realizan la fijación repercuten grandemente en el resultado de las

técnicas inmunohistoquímicas, por ello debe tenerse en cuenta que:
- Los fijadores que actúan por precipitación de proteína:como los fijadores ácidos (Bouoin o
Carnoy) alcohol etílico y los compuestos a base de metales pesados (Zenker) suelen
producir mejores resultados que los fijadores por reticulación (formol).
- El tiempo de fijación deber ser el necesario para preservar la imagen histológica, un exceso
de fijación reducen la inmunoreactividad del tejido.
- El efecto de cada fijador sobre un Ag pueden ser distinto según la localización histológica y
anatomía de dicho Ag.
- En muestra de gran volumen la fijación por inmersión en la solución fijadora proporciona
resultados variables en cuanto a la positividad inmunohistoquímica, ya que las zonas mejor
fijadas se teñirán más que las más profundas.
- Existen determinados Ag de superficie cuya determinación en tejidos fijados no
proporcinan buenos resultados, por ello deben detectarse en tejido congelado sin fijar o
con una fijación muy breve en acetona o cloroformo.
- La fijación debe ser inmediata para evitar la autolisis.

En la mayor parte de los estudios inmunológicos, el formol tamponado al 10% y la solución

Zenker dan buenos resultados. No obstante en casos especiales pueden emplearse otras
soluciones como el parafolmaldehido al 4%. La formalina debe emplearse tamponada cuando
se utiliza como fijador.

En cuanto a la inclusión, aunque los procedimientos habituales de deshidratación y

aclaramiento no deterioran excesivamente los Ag tisulares y en particular los
intracitoplasmaticos, la inclusión habitual tanto en parafina como en alguna resina sintética
puede afectar a los resultados inmunohistoquímicos, así el uso de acetona en lugar de etanol
y el de cloroformo en lugar del xileno mejora notablemente la inmunotinción.

En cuanto el medio de inclusión se utilizan las secciones criostáticas.