Inmuno histoquímica

Procedimiento histopatológico basado en la utilización de anticuerpos para detectar antígenos en

un corte o sección de tejido biológico.

Visualización mediante reacciones antígeno-anticuerpo, permite identificar o visualizar dicha unión

que es incolora gracias a un marcaje

Inmuno: Reacción antígeno-anticuerpo

Histo: Cortes histológicos

Química: Cromógenos.

Ihq: técnica de laboratorio, basada en la inmunología, reacciones antígeno-anticuerpo, en donde

se utilizan anticuerpos MARCADOS para la detección de antígenos.

Antígenos: generan respuesta inmune/lo que se pretende identificar mediante el conocimiento de

su estructura

Anticuerpo:

 Proteínas solubles que crea el sistema inmune.

 Utilizadas por el sistema inmune para identificar y neutralizar antígenos
(inmunoglobulinas)
 Producidas por células plasmáticas

Utilidad:
 Detección de antígenos.
 Identificación de proteínas y polisacáridos.
 Detección de complejos inmunitarios
 Localización de antígenos virales en células infectadas
 Antígenos tumorales en diversas neoplasias

Estructura de un anticuerpo:
Tipos de marcaje:
Fluoróforos: que emiten luz visible en una determinada longitud de onda

Enzimas: forma una reacción que no se deteriora con la luz (las más utilizada)

Observación: microscopio óptico.

¿Para qué se utiliza?

Se utiliza para el diagnóstico de células anormales presentes.

Ejemplo: diferentes estadios de enfermedades como el cáncerà detección de marcadores

tumorales, neoplasias, desarrollo de fármacos y la investigación biológica.

Generación de anticuerpos esquema general:

Descripción de esquema general:

Fusión de un linfocito B del bazo de un ratón inmunizado,

 Métodos de IHQ:

Método directo

Refiere al anticuerpo especifico contra la

sustancia que se quiere detectar.

Está marcado con partículas detectables al

microscopio.

Tejido con virus es reconocido por el anticuerpo contra el antígeno, el anticuerpo estará unido a un
marcador para que pueda ser visulizado.

Refiere a la señal del anticuerpo. Se amplía realizando

sucesivas capas de anticuerpos o marcadores.

La más utilizadas, son la IHQ indirecta con polímeros

conjugados con anticuerpos y agentes reveladores, y las
técnicas de inmunofluorescencia directa.

Se crea un anticuerpo secundario que reconoce el complejo antígeno anticuerpo, este anticuerpo
va marcado con un cromógeno/fluoróforo.

La contra tinción del corte solo es realizada con hematoxilina. Quedando de color azul.
Método puente enzimático

Se utiliza un anticuerpo primario específico que se liga al antígeno

del tejido, un anticuerpo secundario contra la especie del
anticuerpo primario, por esto hace puente entre el primario y el
complejo peroxidasa antiperoxidasa, obtenido en la misma
especie del anticuerpo primario.
 Este sistema implica un anticuerpo primario sin marcar ligado al
antígeno, un anticuerpo secundario biotinilado y el complejo de
avidina o estreptoavidina unido a la enzima (peroxidasa (HRP) o
fosfatasa alcalina (AP)) y finalmente para su visualización el
cromógeno.

La presencia de biotina endógena en el tejido puede brindar

tinción inespecífica de fondo.

Método basado en polímeros

Antígeno: sobre el tejido a estudiar

Anticuerpo primario: contra antígeno diana

Anticuerpo secundario: anticuerpo contra el anticuerpo primario posee una etiqueta que es de
biotina, esta permite que el anticuerpo contra el antígeno sea reconocido por una peroxidasa, se
une a la biotina, la peroxidasa viene conjugada con estreptavidina.

Reacción positiva: La peroxidasa oxida la biotina y generará un precipitado oscuro en el lugar.

Marca café que contrasta con el azul de la hematoxilina. Precipita el cromógeno, que al aplicarle un
colorante será visible.

PASOS GENERALES DE IHQ:

 Obtención de la muestra.
 Fijación.
 Técnica histológica (deshidratación-parafina)
 Recuperación antigénica.
 Bloqueo de sustancias endógenas.
 Aplicación de anticuerpos y cromógenos.
 Análisis histológico, interpretación y diagnóstico.
 Protocolo de trabajo:
1) Desparafinar à 5 min en xilol
à3 min con OH
à3 min con H2Od

2) Recuperación antigénica (sólo para muestras fijadas con formaldehído 10%)

Vaporera 30 min CITRATO x 30 min (95°C)
 10 min enfriar a T° ambiente.
 10 min con Citrato nuevo a T° ambiente (20 min enfriamiento)
 Marcar con plumón hidrófobo.
3) Bloqueo peroxidasa endógena
àPeróxido de hidrógeno al 3% x 10 min
4) Buffer fosfato x 5 min.
5) Bloqueo de proteínas inespecíficas à 20 min SIN LAVAR
6) Incubar con ANTICUERPO PRIMARIO à 30 min a 45°C
7) Lavar con PBS x 5 min.
8) Incubar con ANTICUERPO SECUNDARIO por 20 min.
9) Lavar con PBS x 5 min.
10) Incubar con complejo x 20 min
11) Lavar con PBS 5 min
12) Revelado con DAB.
13) Contra tinción con Hematoxilina x 1min.
14) H2OcàOHàXILOLàMONTAJE.
Utilidad de la IHQ:

 Estirpe histológica à Epitelial/Neural/Mesenquimales/Estromales/Linfoide

 Subpoblaciones à linfocitos (células B / T / NK / Macrófagos).
 Preserva arquitectura tisular à qué célula expresa antígenos / en qué parte los expresa.
 Sustancias extracelulares y microorganismos.

Uso/aplicaciones:

 Diagnóstico de tumor de origen desconocido (¿Dónde está el tumor primario?)

 Clasificación de neoplasias linfoides
 Marcadores de pronóstico en cáncer
 Blancos terapéuticos
 Infecciones

IHQ Factores y calidad de interpretación:

 Fijador à Tipo / Cantidad / Antigüedad / pH/ Tiempo de fijación (máximo 1 hora) en

formol.
 Calidad de los reactivos
 Técnicas y personal
 Validación y control de calidad à Testigos.
 Interpretación

Limitaciones IHQ:

o Observador dependiente
o Disponibilidad de anticuerpos
o Tejido mal Fijado (Necrosis /Artefactos/Tiempo)
o Correlación con morfología y datos clínicos.

Preparación:

No precisa una preparación específica, pero si las muestras para realizarla.

Es un paso determinante en el proceso de estos inmunoensayos.

Cada tejido debe ser adecuadamente recogido y preparado dependiendo de cada estudio

Las muestras deben hacerse en función del método de fijación empleado, que a su vez dependerá
de la técnica de detección elegida.
Procedimiento:
El comienzo de la IHQ comienza desde
1.- Toma de muestra del tejido à debe ser preservado rápidamente para no perder su
formación y evitar descomposición de proteínas celulares.

Tipos de muestras
Muestras Citológicas:
 Cultivos celulares
 Frotis o extensiones
 Cito Spin
 Citología monocapa en medio líquido (ThinPrep)
 Bloques celulares

Muestras Histológicas:
 Congelación
 Inclusión en parafina
 Corte por vibratomo
Fijación: tiene como función estabilizar proteínas tisulares mediante la penetración
Objetivo: detener el metabolismo celular, inactivar enzimas lisosómicas y eliminar
microorganismos.
Características de un fijador ideal

 Buena morfología
 Conservar reactividad antigénica
 No extraer ni difundir el Ag
 Permitir penetración de la reacción IHQ
 Baja toxicidad y bajo costo
Factores para obtener una buena fijación

 Temperatura
 pH
 duración
 velocidad de penetración del fijador
 tamaño de la muestra
 tiempo transcurrido desde la extracción del tejido.
 2.-Fijación y corte
Muestra puede preparase por fijación con secciones de parafina o secciones congeladas. (la más
utilizada es por parafina por su mejor preservación)

3)Después se desparafina e hidrata:

 las secciones de tejido y la recuperación de antígenos
 La fijación con formaldehídos causa reticulación de proteínas
 4)Recuperación de epítopos:
(Enlaces cruzados que une una cadena de polímero a otra formando una red
tridimensional)
Si bien la formalina crea reticulación, permite mantener la estructura del
tejido muy bien, sin embargo, desnaturaliza los epítopos que serán
reconocidos por el Anticuerpo a usar.
Los métodos PAP (peroxidasa anti-peroxidasa), ABC (Avidina-Biotina) y el uso
de enzimas como la fosfatasa alcalina son métodos de fácil ejecución, no
obstante, el problema se radica en la pérdida de INMUNOREACTIVIDAD por
tejidos fijados en formol, en comparación de los tejidos congelados.
El formol, es un fijador de tipo aldehído, que produce entrecruzamiento
entre diversos radicales de aminoácidos (NH2 y anillos aromáticos),
convirtiendo la proteína citoplasmática en una gran macromolécula insoluble.
Dando como resultado el enmascaramiento de los antígenos evitando que los
anticuerpos pueden unirse a ellos.
Una manera de evitar esto es utilizando fijadores como el etanol, Carnoy y
methacarn, pero no son de practica rutinaria.
La recuperación del antígeno se debe realizar mediante aumento de la
temperatura o por reacción enzimática.
Recuperación mediante Calor:
Horno Microondas à rotura de los enlaces se produce por oscilación que
tiene sobre las moléculas de H20 de la solución, generando energía térmica
por ende aumento de la T°.
Importante: enfriar las preparaciones a T° ambiente para restaurar la
estructura terciaria de las proteínas.
Desventajas: Control deficiente de la temperatura, resultados no
homogéneos y limitado numero de preparaciones en la recuperación.
Olla presión y Autoclave: ambos consiguen T° superior de ebullición (130°C),
siendo resultados similares o superiores a los del horno microondas
Ventajas: Mejor uniformidad de la T° y de resultados – procesa mayor
número de preparaciones.
Tratamiento enzimático: Tripsina-Pepsina
Factores: Tampón de incubación y pH
 Citrato sódico à pH 6
 Tampón TRIS y EDTAà pH 9
Desventajas: en tiempos prolongados produce sobre digestión y alteración
morfológica.
Factores como temperatura y pH deben estar a punto para utilizar la batería de métodos para cada
par de anticuerpo y tejido a testear.

a) Hervir tampón citrato a pH 6.0 un minuto o dos en el microondas.

b) En secciones congeladas no es necesario realizar recuperación de antígeno. (los

portaobjetos deben ser secados al aire durante al menos 1 hora antes de la tinción.

Posteriormente las muestras deben ser tratadas con xileno y rehidratadas con alcohol y agua
destilada.

Recomendación: no permitir que la muestra se deshidrate, dejar en cubeta con H2O destilada

Utilizar PAP pen (lápiz hidrófobo que permite ahorrar anticuerpo y precisar la acción de las
soluciones sobre el tejido, abarcando solo áreas de interés.

Permeabilización, implica el tratamiento con un detergente (TRITON) disuelto en PBS. Para

proteínas que se encuentren dentro de la célula.
 Bloqueo
la solución de bloqueo se une a los lugares de unión que no son específicas dentro del tejido con el
fin de prevenir la unión inespecífica de los anticuerpos primario y/o secundario.
Las secciones se incuban con BSA (ALBUMINA DE SUERVO BOVINO) 3% por 20 a 30 min (solución
proteica inocua) o suero del huésped.

Elección del Anticuerpo Primario:

Se deben tener en cuenta factores como:

 Niveles de expresión de la proteína de interés en el tejido a estudiar.

 Que otros anticuerpos se pueden utilizar en ese tejido para realizar co – localización.

 Se deben utilizar anticuerpos producidos en diferentes especies con el fin de poder

distinguirlos a la hora de incubar con los respectivos anticuerpos secundarios.

 Tener en cuenta que tipo de anticuerpo (policlonal o monoclonal) se adapta mejor a las
necesidades.

 Anticuerpos monoclonales: ofrecen una señal más específica

 Anticuerpos policlonales: ofrecen una señal más fuerte en el caso que la expresión de la
proteína de interés sean bajos.
 Anticuerpos de control:
Sirven para testear la especificidad de un anticuerpo primario

a) Control ideal: para testear la especificidad de un anticuerpo primario, es utilizar un tejido

que no contenga la proteína de interés, como, por ejemplo, el tejido de un ratón Knock-out
o células en que la proteína diana se ha silenciado mediante un siRNA.
b) WESTERN BLOT, para detectar si la proteína de interés tiene el tamaño correcto, en el caso
de detectar múltiples bandas en la membrana, es indicativo que el anticuerpo no es capaz
de detectar de forma específica.
c) La ESPECIFICIDAD DEL ANTICUERPO se puede chequear mediante pre-incubación del
anticuerpo primario con el péptido antigénico (test de adsorción) à no necesario en
aquellos anticuerpos purificados por afinidad.
d) Si un anticuerpo es generado de forma casera, se recomienda hacer un western-Blot
utilizando sueros de diferentes etapas del proceso de obtención anticuerpo.

“Controles de calidad certifican la calidad de la técnica empleada, que abarca un conjunto de

procesos que detectan, reducen y corrigen deficiencias de la IHQ”

Factores que analizar:

 Especificidad
 Sensibilidad
 Precisión
 Exactitud
 Reproducibilidad
 Controles IHQ
1.-Falsos negativos: Difícil de detectar / Fácil de solucionar
Detección: Mediante Controles Positivos
Factores causales:
 Factores previos a la IHQ
 Factores durante la IHQ
 Factores posteriores a la IHQ

Causas de Falsos negativos:

 Pérdida de la reactividad del antígeno
 Difusión de componentes tisulares
 Enmascaramiento de epítopos de los antígenos por fijación con aldehídos.
 Pérdida de la actividad de los anticuerpos
 Fallas en el sistema de detección
 Fallas humanas.

2.-Falsos positivos: Problemas graves que conducen a conclusiones erróneas.

Detección: Mediante Controles negativos.
Factores causales:
 Relacionados con el ANTICUERPO PRIMARIO.
 Originados en otras fases del proceso.

Causas de Falsos Positivos:

 Exceso de reactividad inespecífica.
 Reacción cruzada.
 Anticuerpo Primario: Emplear dilución óptima/evitar evaporación durante la
incubación/lavados rigurosos/utilizar anticuerpos de la misma especie de
estudio.
 Otras fases del proceso: fijación inadecuada/secado de las secciones/pigmentos
endógenos/presencia de peroxidasa, fosfatasa alcalina o biotina endógena.
 Controles:
Proporcionan confiabilidad de la interpretación y confirman la especificidad
de la reacción.
 Dilución de un anticuerpo:
Se proporciona una guía de las diluciones a testar juntamente con el anticuerpo.

El estándar de diluciones es desde 1:50 a 1:300 estos son buenos puntos de partida para optimizar
el protocolo.

Se recomienda realizar un panel de diluciones cada vez que se adquiera un nuevo anticuerpo.

Una vez diluido el anticuerpo en solución de bloqueo (ejemplo 3% de BSA en PBS) incubar durante
1 o 2 horas a temperatura ambiente o bien toda la noche a 4°C.

Lavados:
Los lavados se realizan usualmente con PBS. Un lavado rápido y 3 lavados de 5 minutos.

En el caso que la muestra este congelada al ser más frágil se recomienda utilizar una pipeta Pasteur
(utilizar BUFFER TRIS en lugar de PBS).

Detección:
Se utilizan anticuerpos secundarios contra inmunoglobulinas de la especie del huésped en que se
realizado el anticuerpo primario.

Los anticuerpos secundarios pueden estar conjugados a:

A) Fluoróforo
B) Enzima cromogénica (HRP)

La enzima que se escoge para la realización de esta técnica debe cumplir los siguientes
parámetros:

 Estar disponible en una forma altamente purificada.

 Ligada por unión no covalente al anticuerpo o a la biotina.
 No debe alterar la actividad enzimática, es decir ser estable.
 No debe estar presente de forma endógena en el tejido en estudio. Los productos
obtenidos deben detectables y estables

Ejemplos de enzimas:

Peroxidasa: Enzima, su sitio activo es el HRP que le proporciona el color

Al desnaturalizarse por la activación del peróxido de hidrógeno

Sustrato: peróxido de hidrógeno

Cromógeno: DAB (Diaminobenzidina)

Fosfatasa Alcalina: Enzima hidrolítica

Sustrato: p-Nitrofenilfosfato por su grupo fosfato

Cromógeno: BCP/NBT
 Revelado:
DAB: (3,3-diaminobenzidina) es un compuesto químico orgánico muy utilizado en las
tinciones IHQ por su capacidad de producir un pigmento marrón insoluble en presencia de
la enzima peroxidasa.
Cromógeno de elección para las tinciones, se debe tener mucha precaución debido a que
es un conocido mutagénico y carcinógeno potencialà induce daños en el ADN y
mutagénesis en experimentos controlados.

 La eliminación esta sujeta a la normativa ambiental, sanitaria y de seguridad.

 Su transporte y posterior eliminación debe ser realizada por servicios especiales.
 Los demás elementos utilizados en IHQ considerados residuos no se consideran
peligrosos dentro de las normativas, por ello es ventajoso que los instrumentos
que se utilicen en IHQ separen el DAB.
Manipulación
 No pipetear nunca los reactivos con la boca
 Evitar el contacto de los reactivos y las muestras con la piel y mucosas.

Ventajas

 No se desgasta con la luz. A diferencia de los fluorocromos

 Señalizacion permanente, el precipitado siempre va a estar ahí, por lo que la muestra se
puede revisar las veces que sea necesario. A diferencia al marcaje con fluorescencia que
solo puede observarse un par de veces o tres maximo, ya que se desgasta con la luz
fluorescente que los estimula.

Desventajas:

 La señal por DAB no puede ser cuantificada, solo cualificada, por lo tanto no se expresa de
forma numérica, a diferencia de de la flourescencia que si puede ser cuantificada.
Ruido de fondo: para evitarlo añadir siempre un control negativo, es decir una muestra en la que
se ha omitido la incubación con anticuerpo primario.

Diluir el anticuerpo secundario en solución de bloqueo con un factor de dilución entre 1:800 y
1:1000

Interpretación

Patrones de marcación:
Citoplasmático:
 Homogéneo
 Fibrilar à F.Intermedios/F.Finos/F.Gruesos/Microtúbulos
 Granular à Microgranular/Macrogranular
 Puntiforme paranuclear
 Basal
 Mosaico

Membrana:
 Completo
 Apical
 Lateral

Nuclear:
 Homogéneo
 Nucleolar
 Envoltura nuclear

Extracelular:
 Coloide
 Lamina basal
 Fibras y sustancia fundamental

Mixto:
 Membrana y citoplasmático à Difuso/Puntiforme.
 Nuclear y citoplasmático
 Consejos:
 El fluoróforo debe poder visualizar en el microscopio que utilizaras.
 Mantener las secciones en oscuridad para prevenir perdida de señal
 Después de la incubación, lavar secciones con PBS antes del medio de montaje y con
cuidado.
 Evitar burbujas sin presionar el cubreobjetos, puede dañar el tejido.
 Se pueden teñir los núcleos con DAPI durante un lavado o en el momento del agregar el
medio de montaje.
 Se pueden utilizar anticuerpo conjugados directamente con un fluoroforo para ahorrar
tiempo y reducir falsos positivos, pero la señal puede ser baja. Se puede aumentar la señal
utilizando complejos avidina-biotina (ABC) y unirlo con streptavidina-biotina (LSAB).

Algoritmos diagnósticos
(Diagrama de flujo/ Diagnóstico de tumor)
Panel IHQ: tabla que establece el diagnóstico mediante el uso de un conjunto de
anticuerpos.
CITOQUERATINAS à CARCINOMA.
PANEL BÁSICO
VIMENTINA à SARCOMA.
CD45 à LINFOMA.
S100 àMELANOMA / TUMOR NEURAL.

TUMOR INDIFERENCIADO
 Tumor pierde su diferenciación de linaje específico.
 Tumor con una diferenciación de linaje específico, pero con origen primario
incierto, basado sólo en características morfológicas.
DIAGNÓSTICO DEL TUMOR

 PRIMERA ETAPA: Investigación de ANTIGENOS de diferenciación celular

 SEGUNDA ETAPA: Identificación de marcadores más precisos como
ANTIGENO ÓRGANO- ESPECÍFICOS.
 TUMORES INDIFERENCIADOS
AG. HEPT. PANCITO CD45 ACTINA (+) S-100 (+) PLAP (+)

ANTIGENO HEPATOCITARIOESPECÍFICO
ESPECÍFICO KERATINA (+)
PANCITO KERATINA (+)
MUSC. ESP. HMB-45 (+)
CD 45(+)
(+) (+) (+) (+)

HEPATOMA + - . - - -
HEPATOMA CARCINOMA LINFOMA/LEUCEMIA
CARCINOMA - + - - - -
ACTINA (+) S-100 (+)
LINFOMA
MÚSCULO ESPECIFICO (+) - -HMB-45 (+)+ - - (+)
PLAP -
LEUCEMIA

SARCOMA - -MELANOMA- + - CELULAS -

SARCOMA TUMOR
GERMINALES
MELANOMA - - - - + -

TUMOR - - - - - +
CEL.GERMINALES