PRACTICA N° 10

GLICOLISIS PRODUCCION DE ACIDO PIRUVICO DURANTE LA FERMENTACION DE

LA GLUCOSA POR LA LEVADURA Y SU IDENTIFICACION

INTRODUCCION

La glicólisis es el proceso por el cual la glucosa se degrada a Etanol y CO2, y/ó a ácido láctico
dependiendo del organismo que lo efectúe.

Ambas rutas de fermentación son similares hasta la formación de piruvato, manteniendo idénticas
las etapas de conservación de energía que conducen a la formación de ATP.

La glucólisis no solo es la ruta principal para el metabolismo de la glucosa que conduce a la

producción de Acetil−Co−A y a su oxidación en el ciclo del ácido cítrico, sino que también
proporciona una vía importante para metabolizar fructosa y galactosa derivada de los alimentos. La
característica de la glucólisis de proporcionar ATP en ausencia de oxígeno es de significado crítico
biomédico, porque permite al músculo esquelético hacer un trabajo sumamente eficiente aún
cuando la oxidación aeróbica se vuelva insuficiente, a la vez que los tejidos con capacidad glucolítica
pueden sobrevivir a episodios de anoxia. Inversamente, el músculo cardíaco, que está adaptado al
trabajo aeróbico, tiene una capacidad glucolítica relativamente deficiente y supervivencia escasa
bajo condiciones de isquemia. Hay un número pequeño de enfermedades en las que las enzimas del
sistema glucolítico como por ejemplo la piruvatocinasa muestran actividad deficiente; estas
anomalías se manifiestan principalmente como anemias hemolíticas. En las células cancerosas que
proliferan con rapidez, la glucólisis procede a una velocidad mucho mayor que la requerida por el
ciclo del ácido cítrico; por tanto, se produce más piruvato que el que puede ser metabolizado. El
resultado es una producción excesiva del lactato, que favorece un entorno local relativamente ácido
en el tumor, situación que puede tener implicaciones con ciertos tipos de terapéutica contra el
cáncer. También se produce acidosis láctica por deficiencia de piruvato deshidrogenasa.

OBJETIVOS

 Demostrar la formación de ácido pirúvico durante la fermentación de la glucosa por

levadura.

 Producir e identificar ácido pirúvico a partir de glucosa.

 MATERIAL

 Tubos de ensayo
 Tubos de centrifuga
 Trípode, rejilla con asbesto, mechero
 Baño maría
 Pipetas
 Centrifuga
 Vasos de precipitados de 250 y 600 ml.
 Pinzas para tubos de ensayo.
 Solución de glucosa a diversas concentraciones 0.5, 1.0 y 2.0%
 Suspensión de levadura al 5 % en Na2HPO4 y KH2PO4 (18 hrs de fermentación)
 Ácido tricloroacético al 10%
 Nitroprusiato de sodio.
 2,4 dinitrofenilhidracina.
 Hidróxido de amonio concentrado.
 Hidróxido de sodio 0.1N
 Sulfato de amonio sólido.

PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO N° 1. FORMACIÓN DE PIRUVATO

 Marcar dos series de tubos de 3 cada una y adicionar 3 ml de las soluciones de glucosa a las
diferentes concentraciones (0.5, 1.0, 2.0%) a ambas series.

 A una de las series de tubos adicionarles 3 ml de suspensión de levadura con fosfatos de

sodio (0.213 g/100 ml) y marcarlos como A; y a la otra serie adicionarle 3 ml de la suspensión
de levadura con fosfatos de potasio (0.09 g/100 ml) y marcarlos como B.
  Colocar todos los tubos en baño maría a 37ºC por 30 minutos y añadir posteriormente a
cada tubo 1 ml de TCA al 10%. Mezclar vigorosamente y centrifugar a 2500 r.p.m. por 10
minutos. Separar el sobrenadante y desechar el precipitado.

EXPERIMENTO N° 2. IDENTIFICACIÓN DE PIRUVATO

Reacción con nitroprusiato de sodio. En un tubo de ensayo colocar 1 ml del sobrenadante obtenido
y hervirlo. Adicionarle 0.5 g de sulfato de amonio sólido y agitar. Agregar dos gotas del reactivo y
mezclar vigorosamente y dejar deslizar por las paredes del tubo unas gotas de hidróxido de amonio
concentrado, hasta la formación de dos capas. La formación de un anillo verde o azul en la interfase
indica que la reacción es positiva. Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series.
Esquematice e interprete sus resultados.

EXPERIMENTO N° 3. IDENTIFICACIÓN DE PIRUVATO

Reacción con 2,4 dinitrofenilhidracina. En un tubo de ensayo colocar 1 ml del sobrenadante

obtenido y adicionar 1 ml del reactivo, agitar con fuerza y pasar a otro tubo la mitad de la mezcla
formada, y adicionar 1 ml de NaOH 0.1N. La aparición de un color rojo indica reacción positiva.
Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series. Observar la coloración e intensidad
de la misma en cada caso. Esquematice e interprete sus resultados.

RESULTADOS

Tabla 1. Formación de Piruvato en Na2HPO4 y KH2PO4. Cortesía de Kevin Cervantes Tuero

Figura 1. Determinación de Piruvato mediante la reacción de 2,4 dinitrofenilhidracina. En la serie A
se utilizó Na2HPO4 y en la serie B KH2PO4. Foto cortesía de Kevin Cervantes Tuero.

DISCUSIÓN

En esta ocasión discutiremos sobre lo ocurrido en el experimento realizado en esta práctica que
trato sobre la determinación de piruvato.

Al crear la solución de glucosa y levadura ligeramente alcalina o acida en el tubo A y B

respectivamente, y al incubarlos durante una hora a 37ºC se observó que las soluciones seguían
siendo transparentes sin ningún otro cambio. Se llevaron los tubos a la incubadora para
proporcionarles el medio en el que se efectuaran las reacciones referentes al proceso de la glucolisis.
Posteriormente se agitaron las sustancias contenidas en los tubos y se nivelo el volumen de
sustancia para que fuera igual en los dos sacando unos mililitros y depositándolos en otros tubos de
ensayo. El proceso que se lleva a cabo en esta práctica se llama fermentación. Este se efectúa
partiendo de la glucolisis que consiste en una serie de reacciones en la que se involucran varios
intermediarios. La reacción completa de una molécula de glucosa produce dos moléculas de
piruvato, dos moléculas de ATP y dos moléculas de NADH. Este último es un cofactor que se
encuentra en cantidades catalíticas (es necesario reoxidarlo para que no se suspenda el proceso), y
es utilizado por la cadena respiratoria para la obtención del ATP produciendo de esta forma NAD+.
La glucolisis proporciona una cantidad de piruvato que puede tomar dos rutas metabólicas
anaerobias, eso depende del tipo de células que intervengan. Para este caso de la práctica de
laboratorio, se utilizaron soluciones alcalinas y acidas de levadura respectivamente las cuales a
causa de su pH determinaron la cantidad de productos que se obtuvieron. En este caso se presenta
un proceso de fermentación el cual se caracteriza por ser una reacción de obtención de energía en
ausencia de oxígeno en el que el reactivo inicial es la glucosa y se obtienen como productos una
cantidad de piruvato y otra cantidad de etanol que se deriva de la reacción del ácido pirúvico
reducido a acetaldehído y que finalmente produce este alcohol. La fermentación alcohólica se
caracteriza por que el ácido pirúvico formado por la glucolisis se convierte de manera anaerobia en
etanol. En este caso se libera dióxido de carbono y se oxida el NADH reduciéndose a acetaldehído.
La fermentación láctica por su parte es un proceso al que recurren células como la musculares la
cuales presentan deficiencia en la obtención del oxígeno. Otras células como los glóbulos rojos
también recurren a la obtención de energía por este medio ya que no poseen mitocondrias que
realicen el proceso de respiración y obtención de oxígeno. En esta reacción el NADH se oxida y el
ácido pirúvico se reduce transformándose en ácido láctico.

CONCLUSIONES

 Se demostró la formación de ácido pirúvico durante la fermentación de la glucosa por

levadura. La glucosa es asimilada por la levadura mediante la ruta metabólica de la
glucólisis, y el oxígeno es incorporado en el metabolismo energético como aceptor final de
electrones en la cadena respiratoria. El producto final de la glucólisis es el piruvato.

 Se cumplieron los objetivos ya que logramos analizar las reacciones de identificación de

piruvato, identificamos la glucólisis y aprendimos cómo se obtiene la energía a través de los
carbohidratos.

 Producimos e identificamos ácido pirúvico a partir de glucosa. Conocimos el proceso

metabólico de la degradación de la glucosa.

BIBLIOGRAFIA

Sosa Claudio (2021). Reacciones de carbohidratos (metabolismo). Disponible en:

https://www.studocu.com/es-mx/document/universidad-del-valle-de-
mexico/bioquimica/produccion-de-acido-piruvico-durante-la-fermentacion-de-la-glucosa-por-la-
levadura/17329749
 CUESTIONARIO

1. ¿Qué finalidad tiene adicionar a la suspensión de levadura Na2HPO4 y KH2PO4?

La presencia de piruvato en la vía de la glucólisis en un medio ácido que contiene

Na2HPO4 y un medio básico que contiene KH2PO4.

2. ¿Por qué se adiciona TCA al 10%?

Para separar el sobrenadante y desechar el precipitado.

3. Identifique y esquematice las reacciones estudiadas
4. ¿Cuántos enlaces fosfato de alta energía surgen en el catabolismo de la glucosa en
condiciones anaeróbicas?

La ruptura de estos enlaces, como la ruptura de la mayoría de los enlaces, es un proceso

endergónico y consume energía en vez de liberarla. Lo que ocurre es que el cambio negativo
en la energía libre de Gibbs se debe a que los enlaces formados luego del proceso de
hidrólisis (o fosforilación de un residuo por una molécula de ATP) poseen una energía menor
a los que estaban presentes antes de la hidrólisis.

CUESTIONARIO

 Aldas Leonardo (2018). DETERMINACIÓN DE PIRUVATO. Disponible en:

https://es.scribd.com/document/439457706/Determinacion-de-piruvato

 Gonzales Rengifo, G. F., Gonzales Castañeda, C., Espinosa Guerinoni, D., & Rojas Tubeh,
C. (2007). Sobre expresión de genes de las enzimas de la vía glicolítica en células
cancerígenas. Acta Médica Peruana, 24(3), 187-197.