Guías de trabajos prácticos

Procesos de Bioseparación
Ingeniería en Biotecnología

TRABAJO PRÁCTICO N°1

RUPTURA CELULAR

TEORÍA
Las operaciones de ruptura celular se utilizan en los procesos de bioseparación cuando el
producto biotecnológico de interés se encuentra dentro de la célula. Tienen por objetivo
liberar el contenido intracelular para seguir con el proceso río abajo. Existen diferentes
métodos de ruptura celular, clasificados en métodos mecánicos y métodos no mecánicos.
Dependiendo de las características de las células y de la localización sub celular del
producto, algunos métodos resultan más apropiados que otros.
Métodos no mecánicos
Entre los métodos no mecánicos se cuentan la osmosis inversa (adecuada para células
animales, que no poseen pared celular), congelado-descongelado (adecuado para células
animales), shock osmótico (adecuado para productos localizados en el espacio periplásmico
de bacterias Gram negativas), tratamiento con enzimas específicas como lisozima
(adecuada para lisis de bacterias), glucanasas y mananasas (adecuadas para lisis de
levaduras), entre otros. En general, los métodos no mecánicos son más suaves y menos
nocivos para el producto, ya que no implican aumento importante de temperatura.
Métodos mecánicos
Entre los métodos mecánicos se cuentan la homogeneización, la molienda y la
ultrasonicación, los que se pueden adaptar a distintos tipos de procesos. En la figura 1 se
muestran algunos equipos. A escala industrial, los equipos más populares son el
homogeneizador a alta presión y el molino de perlas. Ambos se utilizan para ruptura de
células bacterianas, de levaduras y de plantas. A nivel piloto y laboratorio, los equipos más
populares son el homogeneizador de cuchillas y el procesador ultrasónico.
Figura 1: Equipos para ruptura celular. (a) homogeneizador de pistón, (b) homogeneizador de
cuchillas, (c) procesador ultrasónico, (d) molino de perlas vibratorio, (e) homogeneizador de
Manton-Gaulin (presión – cizalla).

En ultrasonicación se utilizan frecuencias de hasta 20 Hz para producir el fenómeno de

cavitación, lo que se traduce en la ruptura de la pared celular. Se producen zonas de baja
presión en el líquido donde las células están suspendidas, formándose burbujas (vapor) las
que colapsan debido a los cambios de presión. Esto produce fuertes esfuerzos de corte que
fracturan la pared celular. La figura 2 muestra dos procesadores ultrasónicos.

Figura 2: Procesadores ultrasónicos.

Los homogeneizadores de cuchillas son muy similares a las licuadoras caseras, se pueden
usar a nivel laboratorio y son fácilmente escalables a nivel piloto, por lo que han ganado
popularidad para aplicaciones industriales.
Los métodos mecánicos implican aumento de la temperatura en la interfase célula-
elemento mecánico (cuchillas, perlas, vástago, etc.), trayendo como consecuencia la
denaturación de proteínas y otros compuestos termolábiles presentes en la suspensión. Si
el producto es termolábil (como por ejemplo una enzima), es necesario refrigerar durante
la operación.

Diseño de equipos
La ruptura celular se monitorea mediante la cantidad o proporción de producto liberado.
La liberación de producto se comporta de una manera similar a una cinética de primer orden
con respecto a la variable independiente, la que puede ser el tiempo de residencia (en el
caso de molino de perlas y homogeneizador de cuchillas), número de pasadas (en el caso
del homogeneizador a alta presión), número de pulsos (en el caso del procesador
ultrasónico). Al graficar la proporción de producto liberado en función de la variable
independiente se obtiene una curva asintótica, donde la asíntota está dada por la máxima
cantidad de producto que se puede liberar. Además existe una dependencia de las
condiciones de operación, tales como la presión de operación, la velocidad de agitación, la
frecuencia, etc., que puede ser considerada de manera explícita o implícita mediante la
inclusión de constantes en la ecuación de diseño.
Para un homogeneizador de cuchillas, la ruptura celular se puede representar en términos
del tiempo de residencia, según la ecuación 1, donde R es la cantidad de producto liberado,
Rm es la máxima cantidad de producto que se puede liberar, t es el tiempo de residencia y
k es una constante que depende de las condiciones de operación y de las características del
sistema.

log = ∙ (1)

Para un procesador ultrasónico, la liberación de producto depende del número de pulsos o

veces que se somete la suspensión a ultrasonicación bajo condiciones dadas, y se puede
representar mediante la ecuación 2, donde N es el número de pulsos.

log = ∙ (2)
OBJETIVOS
1. Romper células de origen vegetal o microbiano mediante métodos mecánicos.
2. Describir gráficamente el proceso de ruptura celular.
3. Obtener ecuaciones que describan el proceso.

ACTIVIDADES
Nota: todas las mediciones analíticas deben hacerse en duplicado. Los resultados se deben
presentar como media ± desviación estándar en tablas y gráficos. Expresar la calidad de los
modelos mediante el coeficiente de determinación.

1. Ruptura de células vegetales en un homogeneizador de cuchillas

1.1. Lavar y trozar una hoja de vegetal
1.2. Agregar buffer tris 20 mM pH 8.0 e introducir en el homogeneizador.
1.3. Operar el equipo en intervalos de 5 segundos, intercalando la toma de
muestra de sobrenadante (2 – 3 mL), hasta completar 12 muestras. Colectar
las muestras en tubos de microcentrífuga.
1.4. Centrifugar por 5 – 10 minutos o lo necesario hasta obtener un sobrenadante
claro.
1.5. Cuantificar la clorofila liberada mediante espectrofotometría.
1.5.1. Transferir 1 mL de sobrenadante clarificado a una cubeta desechable.
1.5.2. Medir la absorbancia a 645 y 663 nm.
1.5.3. Calcular la concentración (en g/L) de clorofila según las siguientes
ecuaciones:

= 12.7 ∙ − 2.69 ∙ !

" = 22.9 ∙ − 4.68 ∙ !

1.6. Graficar la proporción de clorofila a y clorofila b (por separado, considerando

que son dos productos diferentes) liberadas en función del tiempo de
procesamiento.
1.7. Obtener las ecuaciones que describen el proceso.
2. Ruptura de células de levadura en un procesador ultrasónico
2.1. Transferir a un vaso precipitado aproximadamente 50 mL de suspensión de
células.
2.2. Agitar permanentemente.
2.3. Introducir el vástago del procesador ultrasónico hasta el centro del
contenedor.
2.4. Aplicar pulsos de 4Hz en intervalos de 10 segundos, intercalando un tiempo
de reposo en baño de hielo de 10 segundos. Completar 12 muestras.
2.5. Tomar una muestra de 2 – 3 mL después de cada pulso y guardar en tubos de
microcentrífuga.
2.6. Centrifugar por 10 minutos.
2.7. Cuantificar la concentración de proteína total en cada muestra mediante el
método de Bradford, siguiendo las instrucciones del fabricante del kit.
2.8. Graficar la proporción de proteína liberada en función del número de pulsos.
2.9. Obtener las ecuaciones que describen el proceso.