INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CELAYA

Departamento de Ingeniería Bioquímica

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CELAYA

Departamento de Ciencias Básicas

PRÁCTICA No. 1: CROMATOGRAFÍA DE

PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS

MARIA DEL CARMEN HERNÁNDEZ HERNÁNDEZ

APRIL ALONDRA AGUIRRE GARCIA 21030503

Análisis instrumental.

ING. Bioquímica

Semestre 4

Parcial 1

20/03/2023
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INTRODUCCIÓN.

La cromatografía es una técnica de separación basada en el principio de retención

selectiva, que permite separar los distintos componentes de una mezcla facilitando
su identificación y cuantificación. El nombre de la técnica se debe al botánico ruso
Mikhail Semenovich Tswett, quien usó columnas de vidrio rellenas de carbonato de
calcio para separar pigmentos vegetales.

Las técnicas de cromatografías son muy variadas, sin embargo, el fenómeno de

separación ocurre al hacer pasar una fase móvil fluida (gas, líquido o fluido
supercrítico), que arrastra a la mezcla, a través de una fase estacionaria constituida
por un sólido finamente dividido o un líquido fijado en un sólido.

La cromatografía es un procedimiento físico de división con base en la diferencia de

repartición de los elementos de una mezcla entre 2 etapas inmiscibles, una móvil y
otra estacionaria. Las moléculas del soluto de la mezcla son retenidas por la etapa
estacionaria y arrastradas por la etapa móvil, de forma que, si los elementos de la
mezcla muestran diferentes afinidades por alguna de las etapas, sus velocidades
medias de desarrollo en todo el sistema van a ser diferentes. La cromatografía
puede llevar a cabo 2 funcionalidades primordiales que se excluyen mutuamente:
Dividir los elementos de la mezcla, para obtenerlos más puros y que logren ser
utilizados después (etapa final de muchas síntesis). Medir la cantidad de los
elementos de la mezcla. En esta situación, las porciones de material empleadas
acostumbran a ser bastante pequeñas. La cromatografía es una técnica
drásticamente versátil, que posibilita tanto la división de mezclas como la
purificación de productos, la determinación del nivel de pureza de un compuesto, el
seguimiento de actitudes o la detección y caracterización de compuestos.
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OBJETIVOS.

● Conocer las técnicas de cromatografía en papel, en columna y sus

principales características, así como separar los diferentes pigmentos
fotosintéticos.
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MATERIAL REACTIVOS

● Matraz Erlenmeyer ● Espinacas, cilantro, perejil

● Vasos de precipitados de 250 mL ● Silica gel
● Vaso de precipitados de 100 mL ● Agua destilada
● Vidrio de reloj Lana de vidrio ● Alcohol etílico
● Tubos de ensayo de 15x150 ● Acetona
● Espátula
● Pinzas 1
● Pipetas Pasteur
● Probeta de 50 mL
● Columna cromatográfica
● Varilla de vidrio
● Pipetas de 5 mL

DESARROLLO

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

Preparación de la fase estacionaria (use guantes)

Corte con las tijeras los pliegos de papel filtro en 3 tiras de 1x21 cm
aproximadamente.

Preparación de la fase móvil

1. Pesar 3 porciones de la muestra de 20 g para cada uno de los solventes (hojas

de espinaca, cilantro, perejil y/o acelgas)

2. Licuar cada porción con 20 mL del solvente que corresponda (Etanol, agua y
acetona) hasta que quede homogeneizada la muestra.

3. Colocar en un colador un círculo de papel filtro de cafetera

4. Filtrar la muestra en un vaso de precipitados

5. Rotular cada muestra con el nombre del solvente utilizado al momento de licuar

6. Colocar 2 mL de la muestra en un tubo de ensaye y 5 mL de solvente en la

probeta

7. Colocar la tira de papel filtro dentro de cada uno (aquí el papel filtro es la fase
estacionaria).
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8. Esperar de 30 a 50 minutos para que los pigmentos asciendan por el papel para
su posterior separación.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA (Segunda parte de la práctica 1)

1. Preparar la columna de vidrio rellenándola con el gel de sílice y compacta) la

matriz mediante el paso del eluyente (etanol) y por medio de presión de aire, evitar
que queden burbujas o espacios vacíos, la altura total del empacado deberá ser 16
cm

2. Adicionar la muestra (diluida con en solvente) que se quiere separar en el frasco

correspondiente al reservo del eluyente (el disolvente debe estar en contacto con la
matriz).

3. Depositar el eluyente en cantidades suficientes para aislar el número

correspondiente de fracciones que se requieren (ejemplo: si se quieren aislar 20
fracciones de la cromatográfica con un volumen de 20 mL en cada tubo, deben
usarse 400 mL del diluyente antes de iniciar el proceso de aislamiento).

4. Recoger las fracciones en tubos de forma continua (uno tras otro) durante
aproximadamente 15 minutos (depende la naturaleza del soluto) y después cierre la
llave de la columna.

5. Observar el cambio de color de las fracciones recolectadas y analizar las

fracciones (eluatos) obtenidas para concentración de proteína.

6. Se debe evitar que la fase estacionaria se seque, ya que el soporte se cuarteara,

por lo cual se adicionara constantemente la fase móvil.

RESULTADOS Y ANÁLISIS.

Durante todo el procedimiento fue muy importante que desde un principio montamos
bien nuestra columna para que nuestros evitar que quedaran burbujas de aire y esto
evitará algún error en nuestras fracciones, todo salió muy bien nuestra columna fue
muy buena y nos permitió obtener de forma correcta y adecuada cada tubo con su
respectiva muestra.
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Al momento de obtener nuestras muestras era hora de realizar nuestras pruebas en
nuestras tiras de papel filtro. Para lo cual notamos que si hubo una diferencia en el
tiempo y la distancia que recorrió nuestra muestra dependiendo del medio en el que
se trabajó.

CONCLUSIÓN.

Es muy evidente que la cromatografía que subió más por el papel filtro fue la que
contenia acetona. Esta práctica fue muy interesante, comenzar a conocer estos
métodos de forma práctica y también cómo actuar y hacer de forma correcta nuestra
columna ya que es muy importante que esta sea la adecuada para poder proceder
con el resto de los pasos para este método.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es la constante dieléctrica de un solvente?

La constante dieléctrica y es una magnitud física que nos cuantifica la capacidad de
un material para acumular carga eléctrica, y por tanto energía, entre dos placas
metálicas

2. ¿Cómo se define la polaridad de un solvente?

Polares si contienen enlaces entre átomos con electronegatividades muy diferentes
(como O-H), y no polares, que contienen enlaces entre átomos con
electronegatividades similares (como C-H).

3. ¿Qué factores influyen en una separación por cromatografía de capa fina y por
columna?
La temperatura, pureza de los disolventes, polaridad del eluyente, cantidad de la
muestra y las condiciones físicas en donde se lleva a cabo la cromatografía (si
existen o no corrientes de aire).

4. ¿Qué factores influyen en una separación por cromatografía de capa fina y por
columna?
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Composición, fuerza iónica, temperatura y pH aparente de la fase móvil. Velocidad
de flujo, dimensiones de la columna, temperatura de la columna y presión

5. ¿Indique que eluyente son más comunes usados en la cromatografía en capa fina
y cromatografía de columna?
El hexano, tetraclorometano, cloroformo, diclorometano acetato de etilo y acetona.

6. ¿Qué funciones tienen los reveladores en la cromatografía en capa fina?, ¿cuáles

son los más comunes y químicamente cómo interactúan con las muestras?
Reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados, con los componentes
orgánicos.

7. Explique las diferentes técnicas cromatográficas.

Cromatografía de exclusión molecular: Para la separación en SEC, se utilizan las
propiedades de tamiz molecular de una variedad de materiales porosos. El proceso
de separación depende del tamaño y el volumen hidrodinámico (volumen que ocupa
una molécula en solución), el cual define la capacidad de la molécula de penetrar o
no en los poros de la fase estacionaria. De tal forma que, las moléculas de alto peso
molecular son excluidas de los poros debido a un efecto estérico y pasan
rápidamente a través de la matriz. En el caso de biomoléculas pequeñas, estas
tienen diferente accesibilidad en las cavidades de la matriz porosa.

Cromatografía de intercambio iónico: La separación se lleva a cabo por la

competencia entre proteínas con diferente carga superficial por grupos cargados
opuestamente sobre un adsorbente o una matriz de intercambio icónico.
Actualmente, IEC es una de las técnicas de purificación de proteínas más usadas.
En una separación utilizando IEC, las interacciones hidrofóbicas reversibles entre
los solutos son controladas con el objetivo de favorecer la unión o elución de
moléculas específicas logrando su separación. Una proteína que no tiene carga neta
a un pH equivalente a su punto isoeléctrico (pl) no podrá interactuar con la matriz o
fase estacionaria cargada.

Cromatografía de interacción hidrofóbica: La HIC explota la interacción

reversible entre la superficie hidrofóbica de una proteína y una matriz cromatográfica
con un ligando hidrofóbico a moderadamente altas concentraciones de sal, como el
sulfato de amonio. Este tipo de sales tiene alta polaridad y se unen fuertemente al
agua, lo cual induce la exclusión del agua sobre la proteína y la superficie del
ligando lo que promueve las interacciones hidrofóbicas y la precipitación de la
proteína.

Cromatografía de fase reversa: La RPC es una técnica de purificación capaz de

separar componentes con características muy similares, como proteínas que
difieren en solo un aminoácido e isómeros conformacionales de péptidos. Sin
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embargo, el valor de la RPC puede estar limitado por diversos factores, como el uso
de solventes y su disposición final, así como a los bajos porcentajes de
recuperación debidos a los cambios conformacionales ocasionados por las
interacciones envueltas en el proceso.

BIBLIOGRAFÍA.

A. (s. f.). CROMATOGRAFÍA. Equipos y laboratorio de Colombia.

https://www.equiposylaboratorio.com/portal/articulo-ampliado/cromatografIa