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PRÁCTICA
BFM No. 5 2: CÁMARA DE NEWBAUER

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA Y FISIOLOGÍA MICROBIANA

1. INTRODUCCIÓN

El método de cuenta directa en cámara tiene la ventaja de ser muy rápido y económico,
aunque no se pueden distinguir las células viables y no viables. Se puede calcular el número
de microorganismos en una muestra a partir del volumen de la cámara y de las diluciones de
la muestra que sean necesarias. Sin embargo tiene el inconveniente de que la observación y
cuantificación se dificultan en células muy pequeñas (1-5μm) o en poblaciones de baja
densidad debido al pequeño volumen de muestra que se utiliza (100-200μL).
Para el conteo directo de células se utilizan cámaras diseñadas para contar células sanguíneas
(Newbauer, Petroff-Hauser). Se trata de portaobjetos gruesos con 2 cuadrículas separadas por
surcos. Al colocar el cubreobjetos (de cuarzo) forman cámaras con volumen determinado. Una
vez colocada la laminilla se vierte la suspensión de microorganismos (bacterias, algas,
protozoarios, esporas, entre otros) mediante una pipeta Pasteur o con una micropipeta.
Como se ve en la figura, cada cuadricula tiene 9 cuadrados de 1mm2 de área, y una
profundidad de 0,1mm. Hay cuatro cuadrados
esquineros donde se cuentan células grandes tales
como esporas y leucocitos y hay un cuadrado
central cuya área es de 1mm2 y se encuentra
subdividida en 25 cuadrados. Cada uno de estos
cuadrados mide 0,2mm de lado, por lo que el área
de cada uno sería 0,04mm2.
Al colocar el cubreobjetos de cuarzo sobre el
portaobjetos se tiene una profundidad de 0,1mm
de forma que el volumen contenido en el cuadrado
central será 0,1mm3 (1,0mm2 * 0,1mm). Luego se
convierte este valor a mL que es la manera como se
expresa el número de bacterias por conteo directo.

2. OBJETIVOS

 Realizar conteo directo de bacterias en cámaras de conteo.

 Determinar la cantidad de microorganismos presentes en un cultivo original y en una
dilución del mismo.
 Conocer los principios para aplicar las fórmulas de conteo.
 Identificar las ventajas y las desventajas de este método de recuento microbiano.

3. MATERIALES Y EQUIPOS
 50mL de cultivo de E. coli en fase exponencial en CN a 37°C (12-24 horas de incubación)
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 100mL de solución salina estéril

 8 tubos de ensayo tapa rosca grandes estériles (2*grupo)
 5 pipetas de 10mL estériles (1*grupo + safranina)
 2 pipetas Pasteur para medir 100μL (0,1mL) (1*grupo)
 2 micropipetas (100-1000uL) (1*grupo)
 4 Cámaras de Newbauer (1*grupo)
 Microscopio
 Safranina
 Papel arroz
 Espectrofotómetro y 2 celdas de lectura (1 para el cultivo y otra para el control)

4. PROCEDIMIENTO

1) Se han de formar cuatro grupos para trabajar dentro del laboratorio

2) Antes de iniciar el ensayo, se debe medir la absorbancia del cultivo de E. coli previamente
homogenizado, si es >1,0 realizar dilución 10-1. Utilice solución salina como blanco y
disolvente.
3) Con la pipeta de 10mL, vierta 2mL del cultivo a un tubo de ensayo y añada 2mL de
safranina (mezcla isovolumétrica, tener en cuenta FD). Deje reposar por 5’.
4) Lavar cuidadosamente la cámara de Newbauer sin frotar la zona brillante y el
portaobjetos. Secar con papel arroz.
5) Tome la cámara y fije sobre ella la laminilla. Observe las dos cuadrículas que se
encuentran en la parte superior e inferior (entre los surcos en forma de H).
6) Con una pipeta Pasteur tome 100μL (0,1mL) del cultivo del tubo pequeño y deposítelo
suavemente en el borde de la laminilla.
7) Realice la misma operación en la cuadricula o retícula del frente (si ha lugar a dilución, en
una retícula se colocaría el cultivo puro y en la otra el diluido 10-1, esto con el fin de
observar la diferencia de crecimiento entre ambas poblaciones.
8) Enfoque en 10x. Ajuste la intensidad luminosa para observar tanto las células como las
líneas de la cámara. Pase al objetivo de 40x.
9) Del cuadrado central, que contiene 25 cuadrados
secundarios, cuente 5 de ellos como
se indica en la figura
10) Ha de tenerse en cuenta que
para evitar contar dos veces la
misma célula, se deben contar solo las células que estén desde la
línea central hacia dentro y de los bordes superior y lateral
izquierdo de cada cuadrado que se vaya a contar.
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11) Para obtener el número de microorganismos contados en el cuadro central se calcula así:

#𝒃𝒂𝒄𝒕 #𝒃𝒂𝒄𝒕 𝒆𝒏 𝟓 𝒄𝒂𝒎𝒑𝒐𝒔 ∗ 𝟓

=
𝒎𝑳 𝑭𝑫 ∗ 𝟏𝟎−𝟒 𝒎𝑳
5. CUESTIONARIO APLICADO

1) Calcule el número de microorganismos según fórmula dada.

2) En la cámara se indican los datos: 0,100mm de profundidad y 0,025 (1/400) mm2. ¿Qué
significan estas cifras?

3) Explique matemáticamente el porqué de la fórmula anteriormente descrita para obtener el

número de bact/mL.

6. BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA

 Madigan M, Martinko J & Parker J. Brock: Biología de los Microorganismos. 12ª ed. 2009.
Prentice Hall. New Jersey.
 Prescott, L, Harley J & Klein D. Ejercicios de Laboratorio en Microbiología. 5ª ed. 2002.
McGraw-Hill-Interamericana. España. Madrid.