Introduccin:

La gluclisis es una va importante del metabolismo humano debido a que es

una manera rpida de generar energa para los procesos vitales, sin embargo,
esta va por s sola no completa los requerimientos energticos para las
grandes formas de vida multicelulares. Dada la limitacin energtica de la
gluclisis, las clulas poseen otras vas complementarias para producir ms
energa a partir de los productos generados en la gluclisis: el ciclo de Krebs y
la cadena respiratoria. Estas dos vas generan ms energa con el piruvato
producido al final de la gluclisis y los equivalentes reductores que se dirigen al
ciclo de krebs y a la cadena respiratoria respectivamente. In vivo, estas vas
contienen diferentes tipos de reacciones; de los tipos ms importantes en ellas
son las reacciones de xido reduccin, que son el pilar fundamental de la
cadena respiratoria. Para esta prctica, se estudiarn una enzima de la
gluclisis, una del ciclo de Krebs y componentes de la cadena respiratoria: la
lactato deshidrogenasa, la succinato deshidrogenasa y el citocromo C con la
citocromo oxidasa. En general para evidenciar el transporte de electrones en
las reacciones de xido.reduccin que catalizan estos componentes, se
utilizarn indicadores(azul de metileno y parafenildiamina.
Objetivos:
Aislar las enzimas y los citocromos lo mejor posible
Comprobar la actividad xido reduccin de los componentes aislados
Interpretar correctamente cada tubo preparado
Resultados:
Exp.
LDH

T1
Trans.

SDH

Decol
.

T2
Azul
claro
Sin
Dec.

CIT

Sepia

Trans.

T3
Azul
claro
Dec.
Parcia
l
caf

T4
Azul
rey
Dec.
parci
al
salm
n

T5
Azul
rey
Dec.
parci
al
violet
a

T6
-

T7
-

T8
-

Dec.
parcia
l
Trans.

Decol
.

Caf
rojizo

Violet
a
claro

-Discusin de resultados

Descripcin del sistema de reaccin general de la deshidrogenasa succnica:

En este experimento se busca observar la reaccin de xido reduccin que

sucede en presencia de la deshidrogenasa succnica y el succinato. La
deshidrogenasa succnica cataliza la conversin de succinato a fumarato con la
intervencin del FAD que acta como el agente oxidante en la reaccin. Para
que la enzima contine realizando el proceso cataltico, su cofactor en forma
reducida debe oxidarse, por lo que debe existir una especie qumica que reciba
esos electrones que el FADH2 posee; In vivo, el aceptor final es el oxgeno, pero
para evidenciar la reaccin, se usar otro aceptor, el azul de metileno, el cual
al reducirse pierde la coloracin por la que es nombrado. Para evitar que el
aceptor final sea el oxgeno (ya que el experimento se realiza en condiciones
aerobias) se aade una capa de aceite para evitar que el oxgeno se
introduzca al sistema y evite la decoloracin del azul de metileno que es usado
como indicador.
Para algunos de los tubos, se aade adems malonato de sodio, que dada su
similar estructura respecto al succinato, acta como un inhibidor competitivo.
Esta ltima aseveracin se demostr mediante la adicin de este reactivo a
distintas concentraciones en los tubos.
Tambin se us agua destilada para completar un volumen de 3 mL para cada
tubo.
Interpretacin de los tubos del experimento de deshidrogenasa succnica:
Tubo 1
Contena succinato de sodio, azul de metileno, agua, la enzima SDH y aceite
vegetal. Por lo comentado en la descripcin general, tericamente se esperaba
una decoloracin del azul de metileno por la presencia tanto de la enzima
como del sustrato. Experimentalmente se observ la decoloracin del tubo al
color del extracto(rojo sangre).
Tubo 2
Este tubo actu como un testigo, ya que contena agua, azul de metileno,
succinato de sodio y aceite. La falta de la enzima evidenci que la reaccin no
se lleva a cabo, o si se lleva a cabo, esta tarda demasiado tiempo(lo que es
contraproducente en organismos vivos). Se mantuvo el color azul rey que
presenta el azul de metileno en su forma oxidada.
Tubo 3
En este tubo se aadi la enzima, el azul de metileno, agua y aceite, pero no
sustrato. La reaccin se llev a cabo pero no se observ una decoloracin
considerable. Esto sucedi por la presencia del sustrato en el extracto que
contena la enzima, debido a que era un extracto recin elaborado y poco
tratado.

Tubo 4
Con la adicin de succinato de sodio, enzima SDH, azul de metileno, aceite y
malonato de sodio(1mL), este tubo es el primero de los tubos que evidencian el
efecto de inhibicin competitiva. Se observ poca decoloracin en el tubo, y
fue adems el menos decolorado de los tubos que contenan el inhibidor.
Tubo 5
Este tubo contena, succinato de sodio, agua, aceite, SDH, azul de metileno y
malonato de sodio(0.5 mL). En el tubo se observ una ligera decoloracin,
observndose un color menos intenso que el tubo 4.
Tubo 6
Este tubo contena todo el sistema como los dos anteriores, y 0.25 mL de
malonato de sodio. Se not una mayor decoloracin en comparacin con los
tubos 4 y 5
Tubo 7
En este tubo y en conjunto con los resultados obtenidos en los tubos 4,5 y 6, se
comprueba el tipo de inhibicin que presenta el malonato de sodio respecto al
succinato de sodio. En este tubo se adicion la enzima, el sustrato ( 4 veces
ms concentrado que el inhibidor), el azul de metileno, agua, aceite, y el
inhibidor(0.25 mL); se observ una considerable decoloracin, equiparable a la
del tubo 1. En la serie de tubos que contenan inhibidor, a medida que se
aumenta la concentracin del inhibidor se observa una disminucin de la
decoloracin , lo que indica que la velocidad cataltica es menor; adems, en el
tubo 7 se observa que a mayores concentraciones de sustrato, a pesar de la
presencia del inhibidor, la velocidad de reaccin no se ve drsticamente
afectada. Esto indica, que hay una competencia por el sitio cataltico de la
enzima, y que a mayores concentraciones de inhibidor respecto al sustrato, la
reaccin puede verse completamente detenida.
Experimento deshidrogenasa succnica: El tubo 1 se observa en el extremo
derecho, y el 7mo en el extremo izquierdo.

Descripcin del sistema general de la deshidrogenasa lctica

En el experimento diseado se busca la observacin de la catlisis de la
Lactato deshidrogenasa sobre el lactato. La reaccin produce el cambio de
lactato a piruvato, con el uso de un NAD como coenzima que se ve reducido en
el proceso. Para poder continuar el proceso de catlisis, el NADH (forma
reducida del NAD) debe ceder esos electrones a un aceptor. El aceptor final de
los electrones en la cadena respiratoria In vivo es el oxgeno, pero para
confirmar que la reaccin se lleva a cabo, se introduce un colorante indicador
que acepta los electrones al final del proceso: el azul de metileno. Para evitar la
interferencia del oxgeno, se utiliza aceite, que evita la entrada del oxgeno
dentro del sistema de reaccin. La reaccin que se lleva a cabo es reversible,
por lo que para evitar la reconversin de piruvato a lactato y el consiguiente
uso del NADH para ello, el piruvato formado se hace reaccionar con KCN,
formando una cianohidrina que no es blanco de catlisis para la LDH. Se utiliz
tambin agua para completar un volumen de reaccin igual para cada tubo de
5.3 mL
Interpretacin de los tubos:
Tubo 1
Este tubo contena azul de metileno, aceite, lactato, NAD, enzima LDH y KCN.
Se observ la decoloracin casi total del tubo rpidamente, ya que todos los
componentes necesarios para llevar a cabo la reaccin, como se explic en la
descripcin del sistema general, estaban presentes.
Tubo 2
Este tubo se decolor medianamente y hasta un azul cielo. El tubo contena
LDH, agua, azul de metileno, aceite, KCN y lactato. La falta de la coenzima NAD
debi hacer que el tubo se quedara en el color azul rey del azul de metileno,
pero las condiciones del extracto recin preparado indican que haba presencia
de la coenzima en el extracto.

Tubo 3
El tubo 3 contena KCN, azul de metileno, agua, NAD, aceite y LDH. Se observ
una coloracin similar a la obtenida en el tubo 2, lo que indica que se llev a
cabo la reaccin; sin embargo, por la falta de sustrato en el tubo se esperara
que el tubo quedara en su color original. La explicacin a este evento es similar
a la del tubo 2, esto es, debido a las condiciones del extracto recin preparado
que an contena sustrato.
Tubo 4
En este tubo se tenan todos los componentes del sistema, a excepcin de la
enzima. El tubo no present decoloracin alguna durante todo el tiempo de
reaccin. A pesar de que se aadi NAD del extracto, no se llev a cabo la
reaccin como podra pensarse por la frescura del extracto. Esto se explica por
el tratamiento que recibi el extracto del NAD. Este extracto se purific usando
temperaturas de ebullicin del agua (aproximadamente 92C) por un periodo
de 5 min; a esta temperatura y tiempo, se provoc la desnaturalizacin de la
enzima, volvindola inactiva.
Tubo 5
Carente de KCN, el tubo 5 present una coloracin azul rey, lo que indica que el
azul de metileno no se redujo. Este resultado indica que el proceso cataltico de
la enzima se dirigi completamente hacia la formacin de lactato, como sucede
In vivo en condiciones anaerobias en la va de la gluclisis. El NADH se reoxida
en la conversin de piruvato a lactato, y no hay transporte de electrones por
medio de la cadena respiratoria.

Experimento lactato deshidrogenasa. El tubo 1 se encuentra en el extremo

izquierdo, y siguiendo el orden numrico, el tubo 5 se encuentra en el extremo
derecho.

Citocromos y citocromo oxidasa

Tubo 1
En el primer tubo se adiciono el SDH-CIT y la p-fenilendiamina y agua por lo
cual la reaccin que pudo haberse formado es que la p-fenilendiamina se
oxidara debido al protn del citocromo C, sin embargo no se podra dar en
evidencia que esta se lleve a cabo por que no se agreg ningn indicador (Alfanaftol).
En el tubo 2 tenemos que se agreg agua y la p-fenilendiamina, al tener solo
estos 2 compuestos no se forma ninguna reaccin.
En el tubo 3 tenemos la presencia de un inhibidor (KCN), agua, SDH-CIT, Y la pfenilendiamina, estos compuestos reaccionaron pero de una forma menos
debido al inhibidor, sin embargo como en el tubo 1, no se adiciona ningn
indicador q nos de fe de que la reaccin este sucediendo y de que intensidad, o
dicho de otra forma, la formacin de la p-fenilendimina.
En el tubo 4 tenemos agua y SDH-CIT, con estos 2 compuestos no se realiza
ninguna reaccin de oxidacin, esto es porque el SDH-CIT no tiene a quien
pueda oxidar.
En el tubo 5 tenemos agua, SDH-CIT, p-fenilendiamina y un indicador que
formara un complejo llamado azul de indofenol, que se forma a partir de la pfenilendiamina que se oxida y se vuelve p-fenilendimina y esta con el indicador
alfa naftol se produce una reaccin de condensacin por lo que nos da como
resultado el azul de indofenol.
En el tubo 6 tenemos agua, p-fenilendiamina y el indicador alfa naftol, lo que
hace falta para que se lleve a cabo la reaccin es el agente oxidante, que es el
SDH-CIT, por lo que no se lleva a cabo ninguna reaccin de oxidacin.
En el tubo 7 tenemos el indicador alfa naftol, el SDH-CIT, p-fenilendiamina y un
inhibidor es aadido al tubo (KCN) por lo que la reaccin no se lleva tan
eficazmente como en el tubo 5, ya que el Cianuro reacciona con el citocromo,
evitando la oxidacin de la p-fenilendiamina.

En el tubo 8 tenemos agua, alfa naftol, p-fenilendiamina y el inhibidor, lo

nico que hace falta para llevar a cabo la reaccin es, nuevamente como en el
tubo 6 es el agente oxidante por lo que la p-fenilendiamina no se oxida.

Tu experimento itchy bitchy

Conclusiones
La lactato deshidrogenasa cataliza una reaccin de xido-reduccin sobre el
lactato

La Succinato deshidrogenasa cataliza una reaccin de xido reduccin sobre el

succinato
Los citocromos pueden actuar como agentes oxidantes
El Malonato de sodio es un inhibidor competitivo de la Succinato
deshidrogenasa
El KCN inhibe a la deshidrogenasa succnica y al citocromo c.
Los extractos crudos poseen an sustratos y enzimas, por lo que puede
producirse reaccin sin adicin de ms reactivos
El NAD funciona como coenzima de la lactato deshidrogenasa
El FAD es un grupo prosttico de la succinato deshidrogenasa.
Bibliografa:
Albert L. Lehninger Bioquimica Ediciones Omega Octava reinmpresion 1984.

Van Holde,K.E.; Mathews, C.K.; Ahern, K.G.; "Bioqumica"; Editorial Pearson, 3era Edicin; Espaa
2010