UNIVERSIDAD CIENTÍFICA DEL SUR

CARRERA(S): Medicina Humana / Enfermería / Nutrición y Dietética

PRÁCTICA DE LABORATORIO
CURSO: Bioquímica
PROFESOR(A): Huaranca Tanta, Ruddy Arturo

INFORME DE PRÁCTICA
PRÁCTICA N°: 4
TÍTULO: Factores que afectan la actividad enzimática
GRUPO: 3
INTEGRANTES: Carrillo Delgado, Luciana Micaela– 100 %
Pérez Vargas, María Paula – 100 % Rochabrun
Valdez, Yessenia – 100 %

HORARIO DE PRÁCTICA
FECHA DE REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA: 19 de septiembre de 2022
FECHA DE ENTREGA DEL INFORME : 25 de septiembre de 2022

LIMA, PERÚ
2022
 Departamento Académico de Cursos Básicos
Curso: Bioquímica

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE UNA ENZIMA

INTRODUCCIÓN

La acción de las enzimas es absolutamente necesaria para los sistemas vivos, ya que las reacciones
sin catalizar tienden a ser lentas y las posibilidades que tiene una molécula de cambiar en un
ambiente estable como es el medio biológico, son muy bajas, de ahí que las enzimas proporcionan
el medio adecuado para contrarrestar la lentitud en la realización del cambio.

Las enzimas son moléculas proteicas que catalizan reacciones químicas, siempre que sean
termodinámicamente posibles, las enzimas hacen que las reacciones químicas sean energéticamente
posibles, pero ocurren a velocidades muy bajas, que son cinéticamente favorables y también, dicho
esto, sucede más rápido de lo que ocurriría sin la enzima. Las enzimas actúan sobre moléculas
llamadas sustratos, que se convierten en diferentes moléculas llamadas productos. Casi todos los
procesos en las células requieren que las enzimas ocurran a tasas significativas. Las reacciones
mediadas por enzimas se denominan reacciones enzimáticas.

La reacción específica que controla una enzima depende del área de su estructura terciaria. Esta
región se llama el sitio activo, donde ocurre la actividad con otras moléculas. Por lo tanto, el sitio
activo sólo puede acomodar ciertas moléculas. La molécula de sustrato se une al sitio activo donde
ocurre la catálisis.

La reacción específica que controla una enzima depende del área de su estructura terciaria. Esta
región se llama el sitio activo, donde ocurre la actividad con otras moléculas. Por lo tanto, el sitio
activo sólo puede acomodar ciertas moléculas. La molécula de sustrato se une al sitio activo donde
ocurre la catálisis.

Un sustrato es una molécula sobre la que actúa una enzima. Las enzimas catalizan reacciones
químicas que involucran uno o más sustratos. El sustrato se une al sitio activo de la enzima para
formar un complejo enzima-sustrato. Los sustratos se convierten en productos por la acción de las
enzimas y se liberan del sitio activo, libres para aceptar otro sustrato.

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El sitio o centro activo es la región de la enzima donde se cataliza la unión al sustrato.

La actividad enzimática puede verse afectada por diversos factores, como: Concentración de
Sustrato [S], Concentración de la Enzima [E], pH del medio, influencia de la temperatura y el
efecto de inhibidores y activadores.

Hay dos modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima:

El modelo llave-cerradura: supone que la estructura del sustrato y la del centro activo

son complementarias, de la misma forma que una llave encaja en una cerradura. Este modelo es
válido en muchos casos, pero no es siempre correcto.

El Modelo del ajuste inducido en algunos casos, el centro activo adopta la conformación
idónea sólo en presencia del sustrato. La unión del sustrato al centro activo del enzima desencadena
un cambio conformacional que da lugar a la formación del producto

Una enzima es capaz de acelerar una reacción por que disminuyen la energía que hace falta para
que la reacción se lleve a cabo, entonces, al no tener que alcanzar una energía

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alta, sino baja, a ese nivel bajo de energía se llega antes y la reacción se realiza antes, aunque no
siempre son enzimas, la mayoría de las veces son catalizadores como el platino, que aceleran la
reacción, pero no participan en ella.

Representación de Lineweaver-Burk:

En bioquímica, el diagrama de Lineweaver-Burk se emplea como herramienta gráfica para

calcular los parámetros cinéticos de una enzima. Su utilidad consiste en que el recíproco de
la cinética de Michaelis-Menten es fácilmente representable.

Km (constante para cada enzima) = concentración de S a la que V0 es ½ Vmax. Es una medida de

la afinidad de la enzima por S. Cuanto menor es Km, mayor es la afinidad de la enzima por S.
Vmax: Velocidad máxima teórica = la velocidad cuando todos los centros activos están ocupados
con sustrato.

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Representación gráfica de Michaelis-Menten

La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hipérbola

(Figura de la izquierda). La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental,
y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad
de la Vmax.

En la práctica observaremos la degradación de albúmina por la pepsina.

La digestión de las proteínas se inicia en el estómago gracias a la acción conjunta del ácido
clorhídrico y de la pepsina. La pepsina se encuentra en estado inactivo y el ácido clorhídrico ayuda
a la activación de esta enzima. La pepsina se produce en el estómago, actúa sobre las proteínas
degradándose (desdoblando las proteínas y péptidos), rompiendo los enlaces peptídicos y
proporcionando péptidos.

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Objetivos

● Determinar el Km y Vmax experimental de la pepsina a partir de la gráfica de Vo

contra [S].
● Determinar el Km y Vmax experimental de la pepsina a partir de la gráfica de
dobles recíprocas 1/Vi contra 1/[S].

1. Desarrolla materiales y métodos

Materiales:
● 01 gradilla
● 9 tubos de ensayo 13x100mm
● 01 piseta con agua destilada
● 02 pipetas graduadas o volumétricas 10Ml
● 01 propipeta
● 01 albúmina a [1.3] absorbancia 450 nm frasco 12 Ml
● 01 pepsina 2% frasco 3 Ml
● 01 buffer 24 acetate 0.1M Ph 3.6 frasco 5 Ml Reactivo A
● 01 baño maría 37°C o plancha de calentamiento
● 18 Cubetas de polietileno
● 1 Espectrofotómetro
● 1 Cronómetro
● 1 Vórtex

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Métodos
La actividad enzimática se medirá por la desaparición del substrato (disminución de la
turbidez en los tubos que contienen albúmina), la cual se determinará en el
Espectrofotómetro a 450 nm.

2. Realiza el procedimiento experimental

1) Enumerar 8 tubos de ensayos de 13x100 mm.

2) Adicionar los reactivos como se describen en la tabla para cada tubo de ensayo:

3) Mezclar
4) Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 en el espectrofotómetro. Considerar las
absorbancias como lectura inicial.
5) Luego, incuba los nueve tubos a 37ºC por 5 min.
6) Añadir 0.5 mL de pepsina a cada tubo (del tubo 9 a los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y
8).
7) Incubar a 37ºC por 5 min o hasta que el tubo 1 este claro.
8) Detener la reacción colocando los tubos en un baño de hielo.
9) Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 en el espectrofotómetro.
10) Considerar las Absorbancias como Lectura Final.
11) Hacer la diferencia: Actividad Enzimática = Lectura Inicial - Lectura Final. El
resultado de esta diferencia se considerará como Actividad Enzimática.
12) Graficar en papel milimetrado: Actividad Enzimática en el eje Y versus [S] en el
eje X. 1/Actividad Enzimática en el eje Y versus 1/[S] en el eje X.
13) Calcular el Km y Vmax de la pepsina en cada una de las gráficas.

3. Descripción y análisis de resultados

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● De acuerdo con los resultados, podemos evidenciar que se va a cumplir la fórmula

C1*V1=C2*V2, con lo cual, nosotros podremos calcular la concentración de la muestra
y proceder a realizar la curva de Michaelis-Menten.
● Resultados obtenidos a través de la lectura en el espectrofotómetro:

● Obtención de valores de concentración de albúmina a través de la ecuación

C1xV1=C1xV2 y los valores de la act. enzimática a través de la resta de Li-Lf:

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● Gráfica de Michaelis-Menten realizado en excel con los datos obtenidos:

● Gráfica de Lineweaver-Burk realizado en Excel:

Cálculos:

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1/Vmax= 11.943

Vmax=1/11.943

Vmax= 0.083

Km=pendiente*Vmax

Km= 64.159 x 0.083

Km= 5.32%

4. Realiza conclusiones, recomendaciones y referencias

Conclusiones
● Se determinó el Km y Vmax experimental de la pepsina a partir de la gráfica de Vo
contra [S].
● Determinamos el Km y Vmax experimental de la pepsina a partir de la gráfica de
dobles recíprocas 1/Vi contra 1/[S].
● Después de realizar las actividades, afirmamos que las enzimas requieren ciertas
condiciones para poder actuar, entre estas condiciones se encuentra el pH, la
temperatura, la concentración de la enzima y el sustrato, tanto así que estas pueden
afectar a las enzimas de forma negativa.
● La actividad de una enzima describe qué tan rápido ésta cataliza la reacción que
convierte un sustrato en producto. Esta actividad depende en gran medida de las
condiciones de la reacción, que incluyen temperatura, pH, concentración de la enzima
y concentración del sustrato.
● La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del
nivel de actividad de la misma, por lo que la medida de la actividad es dependiente de
las condiciones, que deben ser especificadas cuando se dan valores de actividad. La
actividad expresa la cantidad de sustrato convertido por unidad de tiempo, teniendo en
cuenta el volumen de reacción.

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● La presente práctica nos permitió determinar que existen reactivos llamados

indicadores capaces de demostrarnos la actividad enzimática a partir de las
variaciones del color que mostraban los tubos después de cada reacción.
● Llegamos a la conclusión de qué las enzimas son proteínas catalizadores cuya función
es acelerar la velocidad de reacciones químicas, también participan en varios
mecanismos de regulación lo cual permite que el metabolismo se adapte a diferentes
situaciones.

Recomendaciones
● Antes de agregar alguna sustancia a un tubo de ensayo, verifique que sea el número
de tubo correcto para un buen desarrollo de la práctica.
● Tenga presente que la parte lisa de las cubetas de polietileno deben de coincidir con
la posición del foco del espectrofotómetro para obtener una correcta lectura.
● Al momento de utilizar la pipeta graduada, asegúrate que la sustancia se encuentre
libre de burbujas ya que estas pueden alterar el resultado del procedimiento
experimental.

Referencias

● Gonzales, J. (2016, 22 marzo). Factores que afectan la actividad

enzimática. Recuperado de:
https://www.blogdebiologia.com/factores-que-afectan-la-actividad-enz
imatica.html
● Nelson, D. L., & Cox, M. M.(2017). Lehninger Principles of Biochemistry
(Seventh Edition) [Libro electrónico]. W.H Freeman Macmillan Learning.
● Salazar, J, Salazar Y, Sotelo J. Guía de prácticas de laboratorio. Bioquímica.
UCSUR. Lima. Edición 2021.

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