Departamento Académico de Cursos Básicos

Curso: Bioquímica I

UNIVERSIDAD CIENTÍFICA DEL SUR

CARRERA(S): MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

PRÁCTICA DE LABORATORIO

CURSO: Bioquímica I

PROFESOR(A): Muñoz Cabana Milagros Yovana

INFORME DE PRÁCTICA

PRÁCTICA N°: 2

TÍTULO: ESPECTROFOTOMETRÍA

INTEGRANTES: Aguilar Flores Ursula Yanet–100117647@cientifica.edu.pe – 100 %

Santos Valenzuela Anita– 100112886@cientifica.edu.pe – 100 %

Tafur Tembladera Abigail– 100113839@cientifica.edu.pe – 100%

Tello Carrasco Fabiola– 100116888@cientifica.edu.pe – 100%

Vergara Poma Doris – 100116599@cientifica.edu.pe – 100%

HORARIO DE PRÁCTICA

FECHA DE REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA: 13 días de septiembre de 2022

FECHA DE ENTREGA DEL INFORME: 20 días de septiembre de 2022

LIMA, PERÚ

2022
 Departamento Académico de Cursos Básicos
Curso: Bioquímica I

PRÁCTICA N° 2

ESPECTROFOTOMETRÍA

1. Introducción
Entre los diversos métodos de análisis de tipo cuantitativo que se utilizan
para la determinación de moléculas o elementos constitutivos de los
organismos se encuentra la espectrofotometría, que utiliza la medición de
la intensidad de la luz transmitida y/o absorbida, a determinada longitud de
onda, por compuestos químicos en solución.

Un espectrofotómetro es un instrumento utilizado en química para medir la

concentración de sustancias, en función de la absorción y transmisión de
luz de una determinada longitud de onda que atraviesa un sistema químico;
y da como resultado la absorbancia que es un valor numérico.

2. Objetivos
● Estudiar e identificar las partes y el uso del espectrofotómetro.
● Aplicar la ley de Lambert – Beer en el empleo del espectrofotómetro.
● Determinar una curva de calibración con la solución de azul de
metileno.

Universidad Científica del Sur 1

 Departamento Académico de Cursos Básicos
Curso: Bioquímica I

3. Materiales y métodos
3.1 Materiales en la mesa de los estudiantes
• 01 gradilla
• 05 tubos de ensayo 13x100mm
• 01 piseta con agua destilada
• 02 pipeta graduada 10mL

3.2 Reactivos en la mesa de los estudiantes

• 01 solución de azul de metileno 1 mg/dL frasco 100mL
• 01 espectrofotómetro
• 01 micropipeta 100-1000 µL y/o de 5-50µL
• 12 cubetas para espectrofotometría
• 12 puntas descartables respectivas

4. Resultados
4.1. Experiencia 1:
Preparación de una curva de calibración
Para elaborar una curva de absorción se preparará el siguiente
sistema:

Solución de azul de metileno 1 mg/dL 1mL

Agua destilada 4 mL

Universidad Científica del Sur 2

 Departamento Académico de Cursos Básicos
Curso: Bioquímica I

Paso 1. Insertamos la propipeta en la pipeta graduada.

Paso 2. Con la ayuda de la pipeta graduada medimos 4 ml de agua

destilada.

Universidad Científica del Sur 3

 Departamento Académico de Cursos Básicos
Curso: Bioquímica I

Paso 3: Vertemos los 4 ml del agua destilada en un tubo de ensayo.

Paso 4: Se extrae 1 ml de la solución de azul de metileno con la ayuda

de la micropipeta (100 ul) y se agrega en el tubo con el agua destilada.

Paso 5: con la pipeta graduada se extrae la solución para verter en la cubeta

(cubrir tres cuartos de la cubeta).

Paso 6: Con ayuda de la piseta cubrimos la cubeta con agua destilada, esta
cubeta se utiliza para calibrar el espectrofotómetro.

Universidad Científica del Sur 4

 Departamento Académico de Cursos Básicos
Curso: Bioquímica I

Se tiene 2 cubetas, (A) con una solución de agua destilada y azul de metileno, (B)
con agua destilada.

Luego se procede a realizar las lecturas en el espectrofotómetro a las siguientes

longitudes de onda: 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680 y 700 nm.
Se obtiene los siguientes resultados:

Universidad Científica del Sur 5

 Departamento Académico de Cursos Básicos
Curso: Bioquímica I

Gráfico: En el eje de la coordenadas “Y” va la absorbancia y en el eje de

coordenada “X” va la longitud de onda. Y a la vez se señala la interpolación.

Se determina el pico de máxima absorción de azul de metileno.

Longitud de onda óptima: 660 nm

4.2. Experiencia 2:
Preparar el experimento de la siguiente manera:

Universidad Científica del Sur 6

 Departamento Académico de Cursos Básicos
Curso: Bioquímica I

Con estos valores, podremos determinar la curva de calibración o el factor de

calibración, la cual determinará la concentración de la sustancia.

Universidad Científica del Sur 7

 Departamento Académico de Cursos Básicos
Curso: Bioquímica I

5. Discusión

Por medio de un espectro de absorción, se determina la longitud de onda óptima de

la absorción de una sustancia dada. El espectro de absorción de una muestra se
obtiene midiendo la absorbancia de la muestra a diferentes longitudes de onda; si
se trabaja en el espectro visible, el rango de medición es de 400-700 nm. Luego, se
grafica la absorbancia vs. la longitud de onda, y se encuentra la longitud de onda
que corresponde con el punto máximo de absorción de la muestra; este es el valor
de longitud de onda con el que se trabajará en el análisis cuantitativo (1). En el
experimento de la preparación de la curva de calibración, para el azul de metileno
al 0.2, utilizando el espectofotòmetro Thermo Scientific, nos resultò que la mayor
absorbancia se daba a 660 nm y para Valderrama (2) La medida de la
concentración de azul de metileno que lo realizò con un espectofotòmetro
Beckman DU640 le resultò la absorbancia a 666 nm de longitud de onda.

Si se diluye sucesivamente una sustancia coloreada y, después de cada dilución,

se mide el valor de absorbancia a una longitud de onda óptima, al representar
gràficamente estos valores (Absorbancia vs. Longitud de onda), se obtiene una
curva de calibración de la sustancia (3). En laboratorio se realizó la medición de
diferentes concentraciones del azul de metileno y se obtuvo la curva de calibración
(gráfico 2) donde se muestra que a mayor concentración, se tiene mayor valor de
absorbancia. En la construcción de la curva se emplea un mínimo de tres puntos
representando las concentraciones frente a sus absorbancias gráficamente (4).

Para el caso de la carrera de medicina veterinaria, el ingreso de nuevos equipos

mucho más sofisticados como el espectrofotómetro nos ayudarán para dar un
diagnóstico más preciso de nuestro paciente; dado que se podría detectar alguna
anomalía o funcionalidad de los órganos encargados de las síntesis más
importantes, analizar los rangos de aceptación y/o comparar resultados. El trabajo
de investigación de García et al. (5), utilizaron muestras biológicas sanguíneas

Universidad Científica del Sur 8

 Departamento Académico de Cursos Básicos
Curso: Bioquímica I

(plasma) de animales elegidos aleatoriamente para realizar mediciones

comparativas tanto por la técnica de espectrofotometría UV-Vis y con el analizador
bioquímico EMP-68. También se utiliza la espectrofotometría para calcular la
concentración de variables bioquímicos como la úrea, la glucosa, las proteínas,
etc., así también para temas de reproducción como concentraciones espermáticas
para determinar la densidad y conteo celular (5).

6. Conclusiones

● Se puede determinar que la espectrofotometría es un método analítico

indirecto porque se basa en la medición de la absorbancia de las radiaciones;
es un gran aporte en la actualidad para la identificación de un analito en una
muestra problema.

● La absorbancia se puede calcular en función de las intensidades de la luz

transmitida y recibida por la muestra. La absorbancia tiene una fuerte
dependencia con la longitud de onda incidente que interacciona con la muestra.

Universidad Científica del Sur 9

 Departamento Académico de Cursos Básicos
Curso: Bioquímica I

Esta interacción es débil o fuerte dependiendo de cómo es el acople de la

radiación electromagnética con la estructura molecular del sistema en estudio.

● La curva de calibración consiste en la obtención de la lectura de absorción o

de porcentaje de transmitancia que corresponde a una secuencia creciente de
concentraciones, estas son graficadas en un papel milimétrico si se trata de
absorbancia o densidad óptica y de papel semilogarítmico si se trata de % de
transmitancia.

● Existe un único valor de longitud de onda en la cual se obtiene la mayor

absorbancia, esta es la longitud de onda óptima con la cual se debe trabajar
para determinar la concentración de las soluciones.

● La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su

concentración.

7. Bibliografía

1. Silvia Quesada Mora. Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica.

1° Ed. Costa Rica: Universidad Estatal a Distancia; 2007.

2. Jose O. Valderrrama. Información Tecnológica. 69 Ed. Chile: Editorial del Norte;

2001.

3. Silvia Quesada Mora. Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. 1°

Ed. Costa Rica: Universidad Estatal a Distancia; 2007.

Universidad Científica del Sur 10

 Departamento Académico de Cursos Básicos
Curso: Bioquímica I

4. Carmen silva garcia, jose garcia bermejo, Luis del castillo torres, jose Manuel
ania palacio. Domingo gomez martinez. Técnico especialista en laboratorio.
España: MAD S.L.; 2006.

5. García Díaz Lorena, Alejo Iturvide Francisco, Marquez Lucio María Azucena.
Determinación comparativa por espectrofotometría y un analizador bioquímico
veterinario de 3 parametros en plasma de caninos . Universidad Guanajuato; 2019.
(Citado 20 de setiembre de 2002 ) . Disponible
en:https://www.jovenesenlaciencia.ugto.mx/index.php/jovenesenlaciencia/article/
view/3159/2638

Universidad Científica del Sur 11