HPLC

Posibilidades y requisitos para su uso en el IMEX

 HPLC: High Pressure Liquid Chromatography
Técnica separativa basada en equilibrios de partición entre una fase estacionaria
y una fase móvil.

En particular el HPLC se diferencia de otras cromatografías en que la fase

estacionaria es particulada, de muy pequeño diámetro para aumentar el área
superficial (en el orden de 1 a 5 um) y por lo tanto genera mucha resistencia al
paso del solvente y es necesario recurrir a una bomba que aumenta la presión (en
el orden de cientos de ATM, se mide en Megapascales)

La clave para cromatografías de calidad es el empaquetamiento de la fase

estacionaria: a mayor uniformidad y mejor empaquetamiento mejor resolución.
 Diseño General de un equipo de HPLC
Reservorio -> Bombas -> Inyección -> Columna -> Detector/es -> Recuperación o Descarte
Escala de Trabajo

ESCALA ANALÍTICA: para obtener información de composición e identidad de

una muestra, dependiendo de los analitos y contando con estándares para
identificación / cuantificación se maneja en el órden de ng

Generalmente asociada al uso de estándares y/o la Espectrometría de Masa

ESCALA SEMIPREPARATIVA: O escala preparativa de laboratorio, para la

purificación de uno o varios compuestos de interés. En el rango de ug a mg.

ESCALA PREPARATIVA: No aplicable al equipamiento disponible. (gramos)

FPLC: Fast Protein Liquid Chromatography
Tecnología mejor adaptada al área Bio

Se utiliza el mismo equipamiento

Las presiones son mucho menores. Se usan columnas de vidrio o plásticas.

La fase estacionario es un polímero orgánico en lugar de silica.

Partículas mayores (10-100 um)

Tipos de cromatografías que pueden realizarse
1. FASE REVERSA: para separación de pequeñas moléculas orgánicas. Usa Sv.

2. INTERCAMBIO IÓNICO: separación por cargas superficiales de macromoléculas

3. EXCLUSIÓN MOLECULAR: Separación por PM / radio hidrodinámico

4. INTERACCIÓN HIDROFÓBICA / HIDROFÍLICA: Separación en función de la

hidrofobicidad / hidrofilicidad de superficie de una macromolécula

5. DE AFINIDAD: Basada en un tipo de interacción específica. Ej: Prot A - Biotina

6. QUIRALES: para separación de isómeros ópticos.

Detección de analitos
Junto con el tipo de cromatografía (tipo de fase estacionaria) es lo que define las
aplicaciones.

Tipos de detectores:
● Espectrofotométricos (incluyendo Arreglo de Diodos)
● De Índice de Refracción
● Conductividad
● HPLC-Espectrometría de Masa
● Fluorescencia

En el IMEX contamos con un detector UV-VIS de L variable entre 200 y 700 nm

(Permite detectar cualquier analito con color visible o Absorbancia en el UV)
Aplicaciones
Separaciones analíticas de pequeñas macromoléculas:
Por ejemplo para la identificación y/o cuantificación de péptidos, nucleótidos,
aminoácidos, drogas. Requiere Estándares.

Purificación a escala laboratorio de compuestos:

Péptidos - Proteínas, Drogas

Lípidos: la aplicación es limitada (requiere derivatizaciones) y en general se

recurre a la Cromatografía Gaseosa. Difícil detección.

Polisacáridos: aplicaciones limitadas y restringidas a métodos por afinidad

(Lectina) o interacción hidrofílica, difícil detección.
 Purification and Characterization of Shiga Toxin 2f, an
Immunologically Unrelated Subtype of Shiga Toxin 2
Craig Skinner, Stephanie McMahon, Reuven Rasooly, John Mark Carter, Xiaohua He
Published: March 26, 2013 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0059760

… A purification regimen was developed for the purification of Stx2f involving cation
exchange, hydrophobic interaction, anion exchange, and gel filtration…

Adaptación y puesta a punto del Método: Trabajo realizado por la CPA Analía Lopez Díaz
(grupo de la Dra Cristina Ibarra) con mi asesoramiento durante 2018 - 2019
FICHA DE PURIFICACIÓN
FECHA: 14/3/2019
Cromatografía: intercambio ionico Columna: Q (intercambio anionico) 5ml
Se parte de un cultivo de 100ml
Flujo: 1 ml/min Loop:1ml Gradiente: lineal (6VC)
Buffer A: TRIS 20mM PH 8 Buffer B: TRIS 20mM NaCl 1M PH 8
ml muestra: 5ml
Tratamiento: Se parte de un glicerol: 125/99 EHEC Stx2 +WT. Ver protocolo pegado en el cuaderno. Se sonica el
pellet con 3 pulsos de 30¨ usando el sonicador de punta grande.Finalmente se filtra por 0,22uM.
Requisitos y Limitaciones de uso
1. Diseñar una estrategia analítica o preparativa según la necesidad
2. Determinar la escala y la muestra de partida
3. Selección de columnas
4. Puesta a punto de la técnica

Solo contamos con una selección muy escueta de columnas. En general cada
nueva aplicación requerirá de que cada grupo gestione inicialmente:
● Columnas adecuadas a la aplicación
● Solventes, incluyendo agua grado HPLC (no conviene utilizar destilada)
● Manejo de muestras y productos (Ej: refrigeración, filtración de muestras)

● Descarte de residuos y solventes ( general, gestionado a nivel central por mi)