Cromatografía Líquida de Alta Resolución

Características instrumentales
Es una técnica que permite separar, aislar e identificar los analitos de una mezcla de
compuestos químicos.

Es utilizada para la separación de componentes de una sustancia determinada, basándose

en diferentes tipos de interacciones químicas.

Mayor sensibilidad.

Fácil adaptación a determinaciones cuantitativas exactas.

Permite trabajar con presiones más altas

Una instalación HPLC está compuesta de varias unidades especializadas las cuales pueden
ser encontradas como entidades separadas o ser integradas dentro de un marco de trabajo
común.

Un sistema de tuberías de diámetros internos muy pequeños (0.1 mm)

asegura la circulación de la fase móvil entre los módulos. Estos tubos
de transferencia están hechos de acero inoxidable o de PEEK (Polyether-etherketone),
un polímero coloreado y flexible, capaz de resistir los solventes comunes bajo
presiones altas (por encima de 350 bares)

Componentes de la HPLC

● Sistema de suministro de fase móvil: Los requisitos para un sistema de

bombeo en HPLC incluyen: la generación de presiones por encima de 400
kg/cm2 , un flujo libre de pulsaciones, un intervalo de caudales de 0.1 a 10
ml/min, el control y reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativo y
componentes resistentes a la corrosión.

Las presiones de las bombas no tienen riesgo de explosión, pero en caso de que se
rompiera el sistema, solo supondría una pérdida de disolvente, esto sí podría tener
un riesgo de incendio.

● Sistema de inyección de muestra: Utiliza bucles de muestra, estos

dispositivos están normalmente integrados en el equipo cromatográfico y hay
bucles intercambiables que permiten la elección de tamaños de muestra
desde 5 a 500 µL.

Con bucles de este tipo se puede introducir la muestra a presiones de hasta 500
kg/cm2 con una precisión relativa de unas décimas por ciento. También existen
válvulas de inyección de micromuestras, con bucles con volúmenes de 0,5 a 5 µL.
 · Columna cromatográfica: Estas columnas pueden tener diámetros internos que
oscilan entre 1 y 4.6 mm y se rellenan con partículas de 3 a 5 µm. Con una
longitud de 3 a 7.5 cm. Tienen como ventaja son más rápidas y tienen el mínimo
consumo de disolvente.

Aplicaciones

La HPLC es particularmente útil para la separación de materiales con grandes

pesos moleculares que presentan una volatilidad muy baja y no pueden separarse
mediante cromatografía de gases. Se usa principalmente en la biotecnología, en
ciencias y en la industria farmacéutica.

La HPLC utiliza una fase móvil líquida para separar los componentes de la muestra.
Los componentes se disuelven en un disolvente y a continuación se hacen pasar
por la columna a una gran presión. A continuación, interactúan con la fase
estacionaria y salen en momentos distintos, igual que ocurre con la cromatografía
de gases. Si una cantidad excesiva de gas permanece disuelta en la fase móvil
líquida a la presión de la columna, el gas puede salir del detector y provocar
grandes picos no deseados. Estos pueden eliminarse mediante el burbujeo de helio
de gran pureza a través del líquido cuando el sistema HPLC no dispone de un
desgasificador integrado. El helio debe presentar unos niveles bajos de
hidrocarburos, ya que estos pueden disolverse en el disolvente y generar ruido de
línea base.

El campo de aplicación de esta técnica es muy extenso. Algunas de las aplicaciones

se enumeran a continuación:

● Productos farmacéuticos: antibióticos, sedantes, esteroides, analgésicos

● Bioquímica: aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
● Alimentación: edulcorantes artificiales, antioxidantes, aditivos
● Contaminantes: plaguicidas, herbicidas, fenoles, PCBs
● Química forense: drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
● Medicina clínica: ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina,
estrógenos.

La cromatografía líquida de alto rendimiento tiene una amplia gama de aplicaciones

en los campos de la bioquímica, química analítica, productos farmacéuticos, ciencia
forense, investigación alimentaria y otras áreas. Por ejemplo, la HPLC también se
utiliza en las pruebas de sustancias prohibidas en atletas.
Detectores.

Detectores:
Un detector para cromatografía es un dispositivo que permite medir, a la salida de la
columna, una propiedad física del eluyente, que deberá depender de la composición de
éste. Se realiza habitualmente en continuo, aunque es posible la utilización de colectores de
fracciones para la identificación y cuantificación de pequeñas fracciones del eluyente.

Detector de absorción UV-visible

El flujo de líquido que sale de la columna pasa a través de una pequeña celda, de pequeño
volumen (entre 1 a 10 μL), para minimizar el ensanchamiento de banda. La medida de la
absorbancia del líquido que la atraviesa en función del tiempo constituye el cromatograma.
Su límite de detección oscila entre 0’1 y 1 ng y puede emplearse en cromatografía de
elución en gradiente.

Fotómetro de filtro: es el detector de absorción UV más sencillo. Emplea una lámpara de

mercurio como fuente y una serie de filtros para aislar la intensa línea a 254 nm, con la que
se mide la absorbancia (variando los filtros se pueden seleccionar otras líneas).
Espectrómetro de barrido: permite realizar el análisis seleccionando una o varias longitudes
de onda en la región de interés.
Espectrómetro de arreglos de diodos: debido a su rapidez, son capaces de registrar la
totalidad del espectro proporcionando un cromatograma tridimensional que muestra la
absorbancia en función de la longitud de onda cada pequeños intervalos de tiempo.

DETECTOR de absorción infrarroja

Las celdas empleadas en estos detectores son similares a las empleadas en los detectores
de absorción UV-vis, excepto por las ventanas ópticas, que en este caso son de cloruro de
sodio o de fluoruro de calcio.
Se emplea en aquellos analitos que absorben radiación infrarroja (IR, cuya longitud de onda
supera los 700 nm), por lo que se debe prestar atención al disolvente utilizado, ya que
muchos de ellos también absorben estas radiaciones.
Los detectores más sofisticados se basan en instrumentos de transformada de Fourier
(FTIR). El límite de detección es de 1.000 ng y también pueden emplearse en cromatografía
de elución en gradiente.
DETECTOR DE Fluorescencia
Se basan en la capacidad de algunos solutos capaces de emitir fluorescencia, o de aquellos
que no lo son pero pueden hacerlo tras un tratamiento adecuado (derivatización).
Los más sencillos emplean una fuente de excitación de mercurio y uno o más filtros para
aislar la radiación fluorescente. Los instrumentos más sofisticados consisten en una fuente
de radiación de xenón y emplean un monocromador de red para aislar la radiación
fluorescente.
Son muy sensibles, siendo su límite de detección de 0’001-0’01 ng y también se pueden
utilizar en elución con gradiente.
DETECTOR DE índice de refracción
En este caso miden una propiedad de la disolución, como es la variación en su índice de
refracción como consecuencia de la presencia de un soluto.
Este tipo de detectores constan de una cubeta con dos compartimentos separados por una
placa de vidrio, por uno de los cuales solamente pasa fase móvil, como referencia, y por el
otro pasa el eluato que abandona la columna y que contiene la muestra. Sobre la cubeta se
irradia un haz de luz que se desvía cuando la muestra aparece en el líquido eluido de la
columna.
Son detectores universales y no dependen del caudal de fase móvil. Sin embargo, no
pueden emplearse en elución con gradiente, sus medidas se ven afectadas por los cambios
de temperatura y no son tan sensibles. Su límite de detección se sitúa entre 100 y 1.000 ng.
DETECTOR DE Dispersión de luz
La dispersión se produce por la interacción de la radiación electromagnética con la materia.
El eluato que abandona la columna se nebuliza mediante un flujo de nitrógeno o de aire y se
vaporiza la fase móvil, quedando únicamente unas finas gotitas de soluto sin evaporar. La
nube de partículas de analito pasa a través de un haz de láser y la dispersión producida es
detectada por un fotodiodo de silicio.
Este detector responde a todos los solutos menos volátiles que la fase móvil y su límite de
detección se encuentra entre 0’1 y 1 ng.

DETECTOR electroquímico
Este tipo de detectores responden a analitos susceptibles de reducirse u oxidarse, como
fenoles, aminas aromáticas, peróxidos, cetonas, aldehídos, compuestos halogenados,
nitroderivados…
Un ejemplo de detector electroquímico es el detector amperométrico, basado en la
oxidación o reducción del eluato en un electrodo de trabajo:

En este electrodo se mantiene el potencial a un valor seleccionado, respecto a un electrodo

de referencia (Ag/AgCl) y se mide la corriente que pasa entre el electrodo de trabajo y un
electrodo auxiliar, de acero inoxidable, en función del tiempo. Para solutos oxidables, son
comunes los electrodos de cobre o de carbón vitrificado. Para solutos reducibles, un buen
electrodo de trabajo es el de gotas de mercurio.

La corriente es proporcional a la concentración del soluto en un intervalo de seis órdenes de

magnitud. Con este detector se debe trabajar en rigurosa ausencia de oxígeno y con
disoluciones acuosas, o de disolventes polares, que contengan electrolitos. Presentan una
gran sensibilidad, con un límite de detección entre 0’01 y 1 ng. Sin embargo, no pueden ser
empleados en elución con gradiente, y dependen de la temperatura y del caudal.
DETECTOR DE conductividad
Estos detectores se basan en los cambios de conductividad de la fase móvil en presencia
de moléculas de analito. Están formados por una celda asilada que contiene dos electrodos
sobre los que se aplica una diferencia de potencial, de manera que se mide la resistencia
que ofrece la mezcla eluida, la cual está relacionada con su concentración.
Este detector es útil para la determinación de analitos iónicos. Su límite de detección se
encuentra entre 0’5 y 1 ng. es sensible a los cambios de temperatura y no puede emplearse
en elución en gradiente.
DETECTOR acoplado a espectrómetro de masas
El principal problema que surge al acoplar un espectrómetro de masas al cromatógrafo
HPLC es la enorme cantidad de disolvente que acompaña al analito, para lo cual se han
desarrollado diversas interfases:
Termovaporizador (termospray): con esta interfase se vaporiza el eluato y se forma un
aerosol, formado por moléculas de disolvente y de analito. Mediante un mecanismo de
ionización química, se ioniza el analito y los iones son conducidos hacia el espectrómetro y
el disolvente es expulsado mediante una bomba. Los analitos deben ser termoestables y
polares.
Interfase de ionización química a presión atmosférica (APCI): utiliza calefacción y nitrógeno
para convertir el eluato en aerosol, del que se evapora el disolvente. Mediante una descarga
eléctrica el analito se convierte en iones que son conducidos hacia el espectrómetro de
masas.
Interfase de ionización por electronebulización (electrospray): el eluato pasa a través de un
capilar metálico, en cuya salida se aplica un fuerte campo eléctrico a la vez que una
corriente coaxial de nitrógeno gaseoso, con lo que se crea un fino aerosol de partículas
cargadas.

Castaños E.(2015) Detectores empleados en HPLC. Obtenido de:

https://cienciadelux.com/2015/08/11/detectores-empleados-en-hplc/

Ventajas y desventajas.

Ventajas
La más importante es la diversidad de sus aplicaciones, tanto en compuestos
orgánicos como inorgánicos, además esta técnica tiene
1. Una alta Velocidad
2. Alta eficiencia de separación por los picos angostos)
3. Precisión y versatilidad ( es extremadamente preciso a la hora de
identificar y cuantificar componentes químicos. (Ya que separa
compuestos no volátiles o térmicamente inestables)
4. Buena selectividad , además de que posee alta sensibilidad de detección
y tiene un funcionamiento automático.
5. Aplicable a sustancias de interés general (industria, salud y
medioambiente)

En comparación con cromatografía de gases, tiene las ventajas de estar libre de

volatilidad y estabilidad térmica de la muestra, y tiene un amplio rango de aplicación;
hay muchos tipos de fases móviles y la eficiencia de separación se puede lograr
mediante la optimización de la fase móvil; generalmente, se analiza a temperatura
ambiente. Sí, no se requiere una temperatura de columna alta.
Desventajas
1. Costo: a pesar de sus ventajas, la Cromatografía Líquida de Alta
Resolución puede ser costosa y requiere grandes cantidades de
compuestos orgánicos costosos.
2. Complejidad: El asombroso número de módulos, columnas, fases
móviles y parámetros operativos de Cromatografía Líquida de Alta
Resolución hace que sea difícil para los principiantes.
3. La Cromatografía Líquida de Alta Resolución tiene una baja sensibilidad
para ciertos compuestos y algunos no se pueden detectar porque se
absorben de manera irreversible.
4. Las sustancias volátiles se separan mejor mediante cromatografía de
gases, ya que por esta técnica tiene menor eficiencia de separación, que
la cromatografía de gases.

Referencias:
Aryal, S. (2018) High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Disponible en:
https://microbenotes.com/high-performance-liquid-chromatography-hplc/