Nota Técnica 145

Protocolo detallado del ensayo de alta sensibilidad

Introducción
El ensayo de alta sensibilidad DeNovix dsDNA permite la detección precisa de muestras de ADN purificado de doble cadena (dsDNA) con
un rango de detección estándar de 100 pg a 250 ng de masa total en volúmenes de 200 µL.   Esto equivale a concentraciones de muestra
de 10 pg/ µL a 250 ng/ µL cuando se utilizan volúmenes de muestra de 1 a 20 µL en volúmenes de ensayo de 200 µL. El ensayo es lineal
para concentraciones de muestra de hasta 250 ng/ µL cuando se ajustan volúmenes a 1 µL de muestra en 199 µL de reactivo de trabajo. La
masa total no debe exceder los 250 ng para obtener los mejores resultados.

Rango extendido
El límite de detección inferior puede extenderse hasta 5 pg/µL de muestra agregando 20 µL de la muestra de 5 pg/µL a 180 µL del reactivo
de trabajo.

Contenido del kit

Hay tres tamaños de ensayo disponibles. El volumen de componentes de cada kit es suficiente para 1000, 250 y 50 (tamaño de evaluación)
de ensayos, respectivamente. Los componentes del kit se muestran a continuación.

Componente 1000 250 EVALUAR

Tinte de alta sensibilidad DeNovix dsDNA (100x) 2 x 1 ml 0,5 ml 100 µL

Tampón de alta sensibilidad DeNovix dsDNA 200 ml 50ml 10 ml

25 ng/µL dsDNA Standard (timo de ternera) 2ml 1ml 0,5 ml

0 ng/µL dsDNA Estándar 2ml 1ml 0,5 ml

El tinte es un químico potencialmente dañino. Tenga en cuenta las precauciones de seguridad de laboratorio universales cuando manipule
el tinte y deséchelo como un desecho químico peligroso de acuerdo con las normas locales.

Compatibilidad de instrumentos
El ensayo de cuantificación de alta sensibilidad de ADNds de DeNovix está diseñado para usarse con fluorómetros o lectores de placas de
fluorescencia equipados con filtros de excitación y emisión para detectar la fluorescencia verde. Las propiedades espectrales únicas del
tinte del kit lo hacen especialmente adecuado para su uso con instrumentos con fuentes de excitación de LED azul (Figura 1).

El kit es compatible con lectores de microplacas de fluorescencia y fluorómetros con las

fuentes de excitación y los detectores de emisión adecuados.

En la Nota técnica 144 se incluyen instrucciones específicas para usar el ensayo

estándar de 2 puntos con DeNovix DS-11 FX, el módulo FX o el fluorómetro QFX .

Figura 1: Espectros de excitación y emisión para el

reactivo de cuantificación de alta sensibilidad DeNovix
dsDNA en presencia de exceso de dsDNA.

Consideraciones de ensayo
El ADN de timo de ternera se proporciona como estándar de referencia, ya que es de doble cadena, altamente polimerizado y tiene
aproximadamente un 58 % de AT (42 % de GC). En ocasiones, puede ser preferible utilizar un estándar de dsDNA similar a las muestras
desconocidas (p. ej., de tamaño similar, lineal frente a circular). Para el ADN bacteriano, considere usar un estándar específico de especie,
ya que el contenido de GC varía ampliamente según la especie.

Aunque muchos instrumentos, incluidos los fluorómetros DeNovix DS-11 FX y QFX, ofrecen la opción de utilizar valores guardados
anteriormente, se recomienda generar una nueva curva estándar en el momento del ensayo para obtener resultados óptimos.

Linealidad del ensayo y límites de detección

Las especificaciones de cuantificación fluorescente a menudo se expresan en una variedad de convenciones. El rango de detección
completo (incluido el rango extendido) de este ensayo se puede expresar en las siguientes especificaciones:

Tabla 1: Límites de detección y linealidad del ensayo de rango alto

Especificación Rango

Masa absoluta por tubo de ensayo 100 pg – 250 ng por 200 µL

Concentración en tubo de muestra 5 pg/µL – 250 ng/µL

Almacenamiento de reactivos
El kit es estable durante 12 meses a partir de la fecha de envío cuando se almacena según las recomendaciones.

Tabla 2: Almacenamiento de reactivos de ensayo de alta sensibilidad

Componente Proteger de la luz La temperatura

Tinte de alta sensibilidad DeNovix dsDNA (100x) Sí 4 o C - Temperatura ambiente

Tampón de alta sensibilidad DeNovix dsDNA Opcional 4 o C - Temperatura ambiente

Estándares de dsDNA Sí 4oC __

Mejores prácticas
Es importante prestar mucha atención a la precisión del pipeteo y a las técnicas generales de manipulación de muestras al cuantificar
cantidades de picogramos de dsDNA.

Utilice pipetas debidamente calibradas y puntas de pipeta sin ADNasa. Utilice la pipeta calibrada más pequeña disponible para
dispensar cada volumen de muestra.
Utilice tubos de PCR transparentes de 0,5 ml de pared delgada para las mediciones de ensayo (DeNovix cat #TUBE-PCR-0.5-500 o
equivalente) o microplacas de pared negra. Si usa tubos, etiquete solo la parte superior, no los lados del tubo.
Evite introducir burbujas de aire en la solución de muestra cuando mezcle muestras.
Prepare la solución de trabajo fresca para cada ensayo. Deseche la solución después de 24 horas.
Asegúrese de que todas las muestras y estándares se traten de manera idéntica en términos de tiempos de incubación y
temperatura.
Aunque las curvas estándar se pueden guardar y reutilizar, se recomienda generar una nueva curva para cada ensayo.
Asegúrese de que todas las concentraciones de muestras en los tubos de ensayo o pocillos de microplacas estén dentro de los
límites del kit de reactivos para obtener resultados precisos.

Protocolo de ensayo
1. Deje que todas las soluciones alcancen la temperatura ambiente antes de usarlas.
2. Vortex, luego centrifugue los viales brevemente antes de abrirlos para minimizar la pérdida de reactivo en la tapa.
3. Prepare la solución de trabajo mezclando el tinte con el tampón de ensayo en una proporción de 1:100, por ejemplo, 100 ul de tinte en
10 ml de tampón. Escale los volúmenes según sea necesario para hacer un volumen suficiente para alícuotas de 190 μL de la mezcla
para cada estándar y desconocido. Mezclar bien antes de usar.
4. Para cada muestra estándar o desconocida, agregue 190 µL de la solución de trabajo por tubo o micropocillo. Ajuste el volumen
cuando agregue más o menos de 10 µL de la muestra desconocida.
5. Agregue 10 µL de cada estándar y entre 1 y 20 µL de la muestra de ADN desconocido al tubo de ensayo o micropocillo y mezcle bien.
6. Incube los estándares y las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos. El ensayo es estable durante  4 horas a temperatura
ambiente.
7. Genere la curva estándar y luego mida las muestras utilizando la fuente de excitación y los filtros de emisión adecuados. El software
DeNovix DS-11 FX o QFX utiliza automáticamente la configuración correcta de excitación y emisión.

Volumen de muestra recomendado

Estas recomendaciones aseguran que las concentraciones de la muestra estén dentro de los límites de detección de masa total del ensayo.
El volumen total del ensayo debe permanecer en 200 µL. Ajuste el volumen de la solución de trabajo en consecuencia. 

Concentración inicial de la muestra Volumen de muestra recomendado

10 pg/µL – 25 ng/µL 10 µL

5 – 100 pg/µL 20 µL
 Concentración inicial de la muestra Volumen de muestra recomendado

25 – 125 ng/µL 2 µL

125 – 250 ng/µL 1 µL

Diluciones estándar
Diluciones estándar No es necesario preparar estándares diluidos cuando se utiliza la opción de ensayo de 2 puntos suministrada. Para la
opción de estándares definidos por el usuario de DeNovix o para usar en lectores de microplacas, prepare un conjunto de estándares de
ADN por dilución en serie del estándar de 25 ng/µL en tampón TE 1X (Tris 10 mM pH 7-8, EDTA 1 mM) como se muestra en la mesa de
abajo.

Estándar ADN TE

25 ng/µL 100 µL de tubo de stock de 25 ng/µL Ninguna

10 ng/µL 40 µL de estándar de 25 ng/µL 60 µL

2,5 ng/µL 25 µL de estándar de 10 ng/µL 75 µL

1 ng/µL 40 µL de estándar de 2,5 ng/µL 60 µL

0,25 ng/µL 25 µL de estándar de 1 ng/µL 75 µL

0,1 ng/µL 40 µL de estándar de 0,25 ng/µL 60 µL

0,03 ng/µL 30 µL de estándar de 0,1 ng/µL 70 µL

0 ng/µL 100 µL de tubo de stock de 0 ng/µL Ninguna

Análisis de los datos

Las concentraciones de la muestra se calculan automáticamente cuando se usa un fluorómetro DeNovix DS-11 FX o QFX.

Para todos los demás instrumentos, siga las instrucciones a continuación:

1. Genere una curva estándar para determinar la concentración de ADN desconocida.

2. Promedie los valores por triplicado para cada muestra y reste el valor de ADN cero promedio de cada punto de datos.
3. Trace los valores RFU de fluorescencia para los estándares de ADN en el eje y y el ADN ng/pozo en el eje x, y ajuste una línea de
tendencia (Figura 2) a través de estos puntos para generar una curva estándar con una intersección y = 0.
4. Utilice la ecuación de la línea de tendencia para calcular la cantidad de ADN desconocido en cada pocillo (y = fluorescencia yx = ng
de ADN por pocillo o tubo).

Figura 2: ADN de timo de ternera medido con el ensayo de

alta sensibilidad DeNovix dsDNA en un fluorómetro DS-11
FX.

Solución de problemas
Confirme que se usaron la fuente de excitación y los filtros de emisión correctos en el momento de la medición.
Confirme que las concentraciones estándar y las diluciones se realizaron correctamente.
Confirme que se usaron las unidades de concentración correctas para la curva estándar y las muestras desconocidas para calcular
las concentraciones de stock.
Si corresponde, asegúrese de ingresar el factor de dilución correcto o el valor agregado del volumen de muestra en el campo de la
pantalla Ejecutar correspondiente antes de realizar una medición.

Apéndice: Compatibilidad de disolventes

Si el ensayo de amplio rango no cubre el rango de concentración de sus muestras, considere usar un kit de ensayo DeNovix dsDNA
alternativo.

Compuesto Concentración máxima en ensayo de 200 µL Disminución de señal (%)

Acetato de amonio 50 mm 0.14

 Compuesto Concentración máxima en ensayo de 200 µL Disminución de señal (%)

Cloruro de sodio 50 mm 0.14

5 mm 0.16
Cloruro de magnesio

Acetato sódico 30 mm 0.11

Etanol 0.01 0.21

Fenol 0.001 0.11

Cloroformo 0.01 0.34

SDS 0.0001 0.31

SDS 1.0E-5 0.09

Función X-100 1.0E-5 0.2

dNTP 100 µM 0.11

Estándares de ADN analizados en ausencia o presencia de los contaminantes enumerados en las concentraciones anteriores. Un resultado de
OK indica que hubo un cambio de <20 % en la señal en ausencia del contaminante. *Mezcla de dATP, dCTP, dGTP, dTTP.

Ensayos DeNovix
Los ensayos DeNovix dsDNA Broad Range y Ultra High Sensitivity son más tolerantes a algunos contaminantes en comparación con los
reactivos del ensayo de alta sensibilidad. Si el ensayo de alta sensibilidad no es compatible con su procedimiento de extracción de dsDNA,
considere usar un kit de ensayo DeNovix dsDNA alternativo. A modo de comparación, los rangos de detección estándar de los tres ensayos
son los siguientes:

Rangos de detección de ensayo

Ensayo DeNovix dsDNA Rango

Amplia gama 0,1 – 2000 ng/µL (rango extendido a 4000 ng/uL)

Alta sensibilidad 10 pg/µL – 250 ng/µL (rango extendido hasta 5 pg/uL)

Sensibilidad ultraalta 0,5 – 300 pg/µL

18-ABR-2022