UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONMA DE NICARAGUA, MANAGUA

RECINTO UNIVERSITARIO RUBN DARO

FACULTAD DE CIENCIAS E INGENIERAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA
ASIGNATURA: ANLISIS INSTRUMENTAL
PRCTICA DE LABORATORIO #1
Calibracin del Espectrofotmetro Ultravioleta/Visible Perkin Elmer Lambda EZ201
I.

Introduccin

La espectrofotometra ultravioleta/visible (UV/Vis) es una de las tcnicas ms

comnmente utilizadas de anlisis instrumental. Por ejemplo, la espectrofotometra es
empleada en qumica clnica, en la industria farmacutica, en anlisis industrial, en
aplicaciones ambientales, en investigacin y muy a menudo en el aseguramiento de la
calidad.
Las regulaciones para el control de calidad como las normas ISO 9000, Buenas Prcticas de
Laboratorio (BPL), Buenas Prcticas de Manufactura (BPM) o procedimientos operativos
estandarizados (POE) en la industria farmacutica requeridos por las ms importantes
farmacopeas (EP, DAB, USP), exigen una regular comprobacin del rendimiento de los
espectrofotmetros utilizados. Estos chequeos incluyen la verificacin de la resolucin, la
exactitud de la longitud de onda as como tambin la examinacin de luz difusa1 y
exactitud fotomtrica (Hellma, 2008).
En adicin a lo anterior, segn la Norma ISO/IEC 17025:2005, para asegurar las
trazabilidad de las mediciones todos los equipos utilizados para los ensayos que tengan un
efecto significativo en la exactitud o en la validez del resultado del ensayo deben ser
calibrados antes de ser puestos en servicio. El laboratorio debe establecer un
procedimiento para la calibracin2 de sus equipos.
II.

Objetivos

Verificar la exactitud fotomtrica en las regiones ultravioleta y visible del

Espectrofotmetro UV/Vis Perkin Elmer Lambda EZ201 utilizando como referencia la
Gua Tcnica: Procedimientos de Calibracin para Espectrofotmetros UV/Vis
publicada por el Laboratorio Internacional de Acreditacin de Nueva Zelanda (IANZ).
1

La luz difusa se define como la luz detectada de cualquier longitud de onda que se encuentra fuera del ancho de
banda de la longitud de onda seleccionada para el anlisis (Owen, 2000).
2
La calibracin es un conjunto de operaciones que establecen, bajo condiciones especficas, la relacin entre los
valores de cantidades indicadas por un instrumento de medida o sistema de medida, o valores representados por
un material de medida y los correspondientes valores emitidos por estndares. La forma usual para realizar la
calibracin es someter cantidades conocidas del mesurando (por ejemplo usando un estndar de medida o
material de referencia) al proceso de medida y monitorear la respuesta de medida (CITAC/EURACHEM, 2002).

III.
N

Materiales y Reactivos

1
2
1
3
6
4
2
2
10
1
10
6
1

Cristalera, Materiales y Equipo

Cristalera Clase A
Matraz volumtrico Pyrex 1000 mL
Matraces volumtricos Pyrex 500 mL
Matraz volumtrico Pyrex 250 mL
Matraces volumtricos Pyrex 100 mL
Matraces volumtricos Pyrex 50 mL
Buretas 50 mL
Buretas 25 mL
Buretas 10 mL
Pipetas Pasteur
Beakers 600 mL Pyrex
Beakers 50 mL Pyrex
Agitadores de vidrio
Plato Petri

Reactivos
Frmula
Grado
CuSO45H2O ACS, ISO; para anlisis
K2Cr2O7
ACS; para anlisis; estndar primario
H2SO4
ACS, para anlisis de metales trazas
HCl
ACS; para anlisis
H2O dest.
ASTM tipo III (6 pisetas 1 L)

6
6
1
4

Materiales de Laboratorio
Soportes universal
Pinzas para buretas
Pipeta de asistencia magntica
Esptulas

Cada equipo de trabajo debe traer:

1 Rollo de papel toalla
1 Marcador Sharpie punta fina
1 Caja de papel Kleenex

2
1
1
1

Equipos de Laboratorio
Balanzas analticas 0.1 mg precisin
Campana de gases
Espectrofotmetro UV/Vis
Par de celdas de cuarzo 10 mm longitud

IV.

Procedimiento Experimental
4.1.

Lavado de la cristalera y el material de porcelana y plstico para el anlisis

1. Se selecciona la cristalera (clase A) y el material a utilizarse en el anlisis.

2. Se enjuaga el material con suficiente agua del grifo y se lava con detergente neutro y
libre de fosfatos Extran MA-02.
3. Se endulza cada pieza con agua destilada.
4. Se introduce la cristalera y los materiales en la tina de plstico, la cual debe contener
5 L de una solucin 1 M de HCl (Cuntos mL hay qu medir de HCl conc.,
= 1.184 g/mL, 37%?) por 24 horas.
5. Se retira cada pieza de la tina de plstico utilizando la respectiva proteccin de
seguridad y se enjuaga bien cada pieza tres veces con agua destilada.

6. Se lleva nicamente la cristalera y el material de porcelana al horno a una

temperatura de 60C para su respectivo secado. El material de plstico se coloca en
posicin invetida y se deja secar por escurrimiento a temperatura ambiente.
7. Se deja enfriar el horno de secado para retirar cada pieza de material y ubicarla en el
estante respectivo, con su tapa o envuelta con papel aluminio; los vasos de
precipitados se colocan en posicin invertida. Los crisoles de porcelana (si hubiesen)
deben ser trasladados a un desecador hasta alcanzar la temperatura del laboratorio.
4.2.

Preparacin de soluciones3

a) Solucin de H2SO4 5 x 10-2 M. Prepare 500 mL de cido sulfrico 5 x 10-2 M aforando

con agua destilada. Cuntos mL hay qu medir de H2SO4 conc. ( = 1.84 g/mL,
96.7%)?
b) Solucin de H2SO4 5 x 10-3 M. Prepare 500 mL de cido sulfrico 5 x 10-3 M utilizando
la solucin a) y diluya con agua destilada hasta el enrase. Cuntos mL hay qu medir
de Solucin de H2SO4 5 x 10-2 M?
c) Solucin 1 de K2Cr2O7 al 0.005%. Prepare 100 mL de dicromato de potasio4 estndar
primario al 0.005% (m/v) diluyendo los miligramos pesados de la sal con la solucin b)
hasta el aforo. Cuntos gramos hay que pesar de K2Cr2O7 estndar primario?
d) Solucin 2 de K2Cr2O7 al 0.01%. Prepare 100 mL de dicromato de potasio estndar
primario al 0.01% (m/v) diluyendo los miligramos pesados de la sal con la solucin b)
hasta el aforo. Cuntos gramos hay que pesar de K2Cr2O7 estndar primario?
e) Solucin de H2SO4 al 1%. Prepare 1 L de cido sulfrico al 1% (v/v) aforando con agua
destilada. Cuntos mL hay qu medir de H2SO4 conc. ( = 1.84 g/mL, 96.7%)?
f) Solucin de CuSO45H2O (patrn primario) al 2%. Prepare 100 mL de solucin de
CuSO45H2O al 2% (m/v) diluyendo los gramos pesados de la sal con la solucin e)
hasta el aforo. Cuntos gramos hay que pesar de CuSO45H2O?
g) Solucin stock de CuSO45H2O (patrn primario) 0.1 M. Prepare 250 mL de solucin
stock (de reserva) de CuSO45H2O 0.1 M diluyendo los gramos pesados de la sal con la
solucin e) hasta el aforo. Cuntos gramos hay que pesar de CuSO45H2O?
h) Set de Estndares de CuSO45H2O (0.00, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 y 0.10) M. Prepare seis
estndares de CuSO45H2O, midiendo alcuotas de la solucin g) y afore a 50 mL
utilizando la solucin e) (blanco).
Tabla 4.1. Set de Estndares de CuSO4.5H2O
Volumen Volumen Concentracin
N
del Stock del Blanco del Estndar
1
? mL
? mL
0.00 M
? mL
? mL
2
0.02 M
3

Si es necesario calcular el peso molecular de una sustancia para preparar una determinada solucin,
utilcese la Tabla Peridica NIST (Anexo) para el clculo del peso molecular de dicha sustancia (incluya todas
las cifras significativas).
4
Anticipadamente el dicromato de potasio deber ser secado por un tiempo de 30 60 minutos a una
temperatura de 140 150C.

3
4
5
6
4.3.

?
?
?
?

mL
mL
mL
mL

? mL
? mL
? mL
? mL

0.04
0.06
0.08
0.10

M
M
M
M

Exactitud de la escala fotomtrica (absorbancia) en la regin espectral UV

1. Utilizando como referencia la solucin b), ajuste la lnea base del espectrofotmetro.
Endulce las celdas de cuarzo (referencia y muestra) con la solucin b) y ajuste a cero la
lnea base del equipo.
2. Con ayuda del Docente configure el instrumento para realizar un barrido en la regin
UV del espectro electromagntico de 400 a 200 nm.
3. Para verificar el rango de absorbancia de 0.2 0.7 utilice la Solucin 1 de K2Cr2O7.
Tome la celda de la muestra, vaciando su contenido en el beaker de residuos. Endulce
la celda con agua destilada al menos tres veces, proceda de igual forma con la
Solucin 1 de K2Cr2O7, la cuarta vez llene cuidadosamente la celda (de modo que no
queden burbujas de aire en el seno de la solucin). Limpie las paredes exteriores de la
celda utilizando papel Kleenex y coloque la celda en el portacelda de la muestra.
Cierre el paso de luz hacia las celdas.
4. Utilizando el espectro obtenido por el espectrofotmetro, evale la precisin de la
escala de absorbancia de 0.2 0.7. (Tabla 5.1)
5. Con ayuda del Docente configure el instrumento para realizar un barrido en la regin
UV del espectro electromagntico de 400 a 200 nm.
6. Para verificar el rango de absorbancia de 0.4 1.4 utilice la Solucin 2 de K2Cr2O7.
Proceda de la misma forma descrita en el enunciado 2. de este acpite.
7. Utilizando el espectro obtenido por el espectrofotmetro, evale la exactitud de la
escala de absorbancia de 0.4 1.4. (Tabla 5.1)
8. Segn la Gua Tcnica las diferencias porcentuales (error relativo porcentual) deben
ser menores del 2% para considerar como aceptables los resultados obtenidos.
4.4.

Exactitud de la escala fotomtrica en la regin espectral Visible

1. Utilizando como referencia la solucin e), ajuste la lnea base del espectrofotmetro.
Endulce las celdas de cuarzo (referencia y muestra) con la solucin e) y ajuste a cero la
lnea base del equipo.
2. Para verificar la exactitud de la escala fotomtrica utilice la Solucin de CuSO45H2O al
2%. Tome la celda de la muestra, vaciando su contenido en el beaker de residuos.
Endulce la celda con agua destilada al menos tres veces, proceda de la misma forma
descrita en el enunciado 2. del acpite anterior.
3. Con ayuda del Docente configure el instrumento para realizar un barrido en la regin
Vis del espectro electromagntico de 800 a 500 nm.
4. Utilizando el espectro obtenido por el espectrofotmetro, evale la precisin de la
escala de absorbancia en la regin visible. (Tabla 5.2)

5. Segn la Gua Tcnica las diferencias porcentuales (error relativo porcentual) deben
ser menores del 2% para considerar como aceptables los resultados obtenidos.
4.5.

Prueba de Linealidad en la regin espectral Visible

Soluciones de sulfato de cobre de diferentes concentraciones pueden utilizarse para

comprobar la linealidad de la escala de absorbancia. El uso de las absorbancias a 600 nm y
650 nm es particularmente til para examinar el borde inferior de la escala de absorbancia
(IANZ, 2005).
1. Utilizando como referencia la solucin e), ajuste la lnea base del espectrofotmetro.
Endulce las celdas de cuarzo (referencia y muestra) con la solucin e) y ajuste a cero la
lnea base del equipo.
2. Con ayuda del Docente configure el instrumento para realizar la lectura fotomtrica
del Set de Estndares de CuSO45H2O (0.00, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 y 0.10) M a longitud
de onda variable (multiwavelength). Establezca como primera longitud de onda
1 = 600 nm y como segunda longitud de onda 2 = 650 nm. Asegrese de configurar el
instrumento para que lea cinco veces cada estndar.
3. El espectrofotmetro estimar e imprimir una curva de calibracin promedio a estas
longitudes de onda, sin embargo se deber comprobar el ajuste lineal de dicha curva
ingresando los datos en una hoja de clculo (Excel, Gnumeric, Minitab, etc).
4. Construya la curva de calibracin promedio graficando en el eje la concentracin de
los estndares de CuSO45H2O versus el eje expresando las absorbancias a 2 1
(Tabla 5.3).
5. Calcule el coeficiente de correlacin y pruebe estadsticamente si existe una bondad
de ajuste lineal significativa de los estndares de CuSO45H2O con el borde inferior de
la escala de absorbancia (Tabla 5.4).
V.

Resultados
Tabla 5.1. Valores de referencia de absorbancias para K2Cr2O7 en 5 x 10-3 M H2SO4.

Longitud
de onda
(nm)
235 (min)
257 (max)
313 (min)
350 (max)

Absorbancia/
Solucin 1
(Gua Tcnica)
0.626
0.727
0.244
0.536

Absorbancia/
Solucin 2
(Gua Tcnica)
1.251
1.454
0.488
1.071

Absorbancia
Absorbancia
Experimental/ Experimental/
Solucin 1
Solucin 2

Error
relativo %
Solucin 1

Fuente: IANZ, 2005, pg. 5.

El error relativo porcentual puede obtenerse a partir:

|

Error
relativo %
Solucin 2

Figura 5.1. Espectro tpico de una solucin 0.006% de K2Cr2O7 en HClO4.

Soluciones de dicromato de potasio en
cido sulfrico o perclrico pueden
utilizarse para verificar la escala
fotomtrica de la regin UV.
El K2Cr2O7 muestra un espectro con
mximos picos caractersticos a 257 nm
y 350 nm; y mnimos a 235 nm y 313
nm. Los valores de referencia de las
absorbancias a estas longitudes de onda
estn dados en la Tabla 5.1.
Fuente: Hellma, 2008, pg. 10.

Tabla 5.2. Valores de referencia de absorbancias para CuSO4.5H2O (2%) en 1% H2SO4.

Longitud de onda
Absorbancia
Absorbancia
Error relativo %
(nm)
(Gua Tcnica)
Experimental
600
0.068
650
0.224
700
0.527
750
0.817
Fuente: IANZ, 2005, pg. 5.

Tabla 5.3. Absorbancias del Set de Estndares de CuSO4.5H2O.

Concentracin Absorbancias Absorbancias Absorbancias
N
del Estndar 1 = 600 nm 2 = 650 nm
a 2 1
1
0.00 M
2
0.02 M
3
0.04 M
4
0.06 M
5
0.08 M
6
0.10 M
Las absorbancias de cada estndar son el promedio de las cinco lecturas
realizadas por el espectrofotmetro a cada .

Tabla 5.4. Parmetros de la curva de calibracin promedio del borde

inferior en la regin espectral visible 650 600 nm.
Coeficiente de regresin o correlacin ( )=
Pendiente ( )=
Intercepto al origen u ordenada( )=
Ecuacin de Regresin=

Existe correlacin significativa?

Bibliografa
Hellma. (2008). Calibration standards for spectrophotometers. Mllheim: Hellma GmbH & Co. KG.
IANZ. (Mayo de 2005). Technical Guide: UV/Vis Spectrophotometer Calibration Procedures.
Auckland, New Zealand.
Owen, T. (2000). Fundamentals of UV-visisible spectroscopy. Germany: Agilent Technologies.