R.

NAVARRO
MANUAL DE PRACTICAS DE BIOLOGIA B. R. MESTAS

PRÁCTICA N° 7

ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS EN GELES DE

AGAROSA

OBJETIVO
 Separar e identificar diferentes fragmentos de ácidos nucleicos usando
electroforesis en geles de agarosa

INTRODUCCION
La concentración e integridad del DNA extraído, así como el tamaño de distintos
fragmentos de DNA (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante
electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separación de
moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada (agarosa,
acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo
eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el
grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo
que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis.

La resolución y velocidad de separación de fragmentos de DNA por electroforesis son

reguladas a través de la concentración de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado
durante la electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor
tamaño migran más rápidamente hacia el ánodo que aquellos de mayor tamaño. Al aumentar la
concentración de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel,
permitiendo obtener una mayor resolución en los fragmentos de menor longitud. El incremento del
voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel.

Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción
con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración
mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes
fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido nucleico. El
bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de DNA y RNA. Sin embargo, éste
es un reactivo altamente tóxico, con propiedades mutagénicas, por lo que debe ser manejado con
extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos,
como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vista Green y Syto60, desarrollados
específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis.

La técnica para la cuantificación de DNA consiste simplemente en la utilización de una

secuencia de concentraciones de solución patrón de DNA con la que se comparan muestras de DNA
de concentración desconocida. El cálculo de las concentraciones se hace bajo la luz ultravioleta
según la fluorescencia. Debe evitarse la exposición prolongada a la luz ultravioleta, incluso con
máscara de protección. La estimación de las concentraciones de DNA puede realizarse sobre una
fotografía digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de imágenes.
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La concentración de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamaño
del segmento de DNA que se quiera visualizar. Los segmentos de gran tamaño, el del DNA total
(proveniente de una extracción de DNA), deben trabajarse con concentraciones del 0.8% y a
voltajes de 60V para evitar la fragmentación del mismo. Los segmentos de 1,500 pb en adelante con
geles al 1%, los segmentos de 500 pb a 1,500 pb en geles 1,5% o 2% y los pequeños segmentos de
100 pb a 500 pb (los microsatélites por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos el voltaje puede
variar de 20v a 120v de pendiendo de la velocidad a la que quiera que migre el DNA, a voltajes
elevados más rápido corren las muestras.

La pureza de la agarosa y de la solución tampón (TAE o TBE) puede variar según la

finalidad del ensayo. Es posible reutilizar una solución de agarosa cuando el fin es utilizarla sólo
para visualización de algún producto de PCR. No se debe reutilizar cuando se va a cuantificar DNA
ni a extraer bandas a partir del gel. Para reutilizar la solución de agarosa se recomienda guardar el
gel en un envase con tapa, esto evita la evaporación y la entrada de polvo. En caso dado de que se
evapore algo de la solución se puede completar el volumen con solución tampón limpia.

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIALES Y REACTIVOS
1. Muestra DNA
2. Marcador de peso molecular.
3. Cámara de electroforesis y accesorios requeridos: soporte, peines, tabla niveladora, burbuja
niveladora, etc.
4. Solución amortiguadora de Tris-Boratos-EDTA (TBE). La solución se prepara 10X y se utiliza
1X. Para preparar 500 ml de una solución 10X TBE mezclar: 54 g de Tris Base (PM= 121.14
g/mol), 27.5 g de ácido bórico (H3BO3) (PM= 61.83 g/mol), 20 ml de EDTA sódico (0.5 M, pH
8.0), llevar a 500 ml con agua destilada y autoclavar.
5. Gel de agarosa al 1% en TBE con bromuro de etidio. Precaución: el bromuro de etidio es un
agente mutagénico, utilice guantes para manipular cualquier material o solución que contenga
este químico.
6. Amortiguador de muestra con azul de bromofenol.
7. Tubos de 1.5 ml.
8. Beaker o erlenmeyer de 125 ml.
9. Micropipeta de 20 μl con sus respectivas puntas.
10. Lámpara de UV. Precaución: la luz ultravioleta puede dañar sus ojos. NUNCA observe un
gel bajo la luz ultravioleta sin el uso de anteojos que filtren dicha luz.
11. Guantes.

PROCEDIMIENTO
1. Ubicar la zona de electroforesis y tener cuidado con los materiales, evitar manipular objetos
ajenos al área.
2. Preparar Buffer TBE al 1X

Preparación del gel de agarosa al 1%

3. Pesar 400 mg de agarosa en polvo.
4. Montar los soportes y materiales adecuados para preparar el gel procurando nivelarla
superficie, verificar que no existan fugas y colocar los peines adecuados.
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5. Depositar la agarosa en el matraz de 250 ml y agregar 40 ml del Buffer TBE 1X. Calentar la
agarosa en el horno de microondas por 1 min o hasta que se disuelva perfectamente.

NOTA: Manejar con extremo cuidado el matraz y evitar respirar los vapores
del contenido

6. Enfriar un poco sin que se solidifique la agarosa y agregar una gota de bromuro de etidio*
(manipular el reactivo lo menos posible y evitar derrames o mancharse). Mezclar perfectamente
hasta homogeneizar y verter el contenido en el molde.
7. Esperar a que solidifique (aproximadamente 20 min) y colocar el gel en la cámara de
electroforesis de tal forma que los pozos principales queden del lado correspondiente al polo
negativo (color negro). Llenar la cámara hasta la marca indicada con TBE 1X y con precaución
retirar los peines.

Preparación de las muestras

8. En un papel parafilm, colocar 3 µL del buffer de carga para 10 µL de muestra.Mezclar la
muestra con el buffer y vaciar en un pozo del gel (dejar libre el primer pozo para el marcador
de peso molecular) para cada una de las muestras.
9. Concluido el proceso, tapar la cámara de electroforesis haciendo coincidir los polos: positivo
con positivo y negativo con negativo. Conectar la cámara a la fuente de poder y programar la
corrida a 90 volts constantes durante 20-30 min.

Visualización de resultados
10. Sacar el gel de la cámara de electroforesis
11. Examine el gel bajo la lámpara de luz ultravioleta para determinar la posición de las bandas
en el gel.
12. Tomar la foto del gel.

OBSERVACIONES
1. Describa y represente con un dibujo los pasos a seguir para realizar una electroforesis en gel de
agarosa. Donde sea necesario, indique las medidas de seguridad que se deben tener en cuenta
para llevar a cabo este procedimiento.

CUESTIONARIO
1. Además del bromuro de etidio, ¿Qué otros compuestos se pueden emplear para visualizar
moléculas de DNA? ¿En qué se fundamenta su uso?

2. ¿Cuál es la función del buffer de carga “naranja G 6x”? Investigue la composición

química de un buffer de carga.

3. Investigue y represente un marcador de peso molecular para DNA y RNA e indique el rango
de tamaños de dicho marcador

BIBLIOGRAFÍA
1. BioRad. Manual de instrucciones de la cámara mini sub cell para electroforesis en geles de
agarosa.

2. Adrien Gallou, Alba Priscilia Suaste Dzul, María Guadalupe Serna Domínguez, Gilda Yadi
Andrade Michel (2015) Manual de prácticas del Laboratorio de Biología Molecular. Servicio
Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria. SENASICA.