17.10.08
03
AOAC Official Method 997.03
Listeria monocytogenes and Related Listeria Species in
Selected Foods and from Environmental Surfaces
Vissual Immunoprecipitate Assay (VIP)
(Applicable to detection of Listeria monocytogenes and
related Listeria species in dairy foods, red meats, pork,
poultry and poultry products, seafood, fruits, vegetables,
nutmeats, pasta, chocolate, eggs, and bone meal, and
environmental surfaces.)
Caution: Listeria monocytogenes infections can cause
fetal death. Pregnant women, the elderly, and
potentially immunocompromised individuals must be
prohibited from laboratory rooms or areas where L.
monocytogenes enrichment, isolation, and identification
procedures are in progress. Decontaminate all spent
media and equipment used in test prior to disposal of
media or re-use of equipment.
See Tables 997.03A (from 1997 study), B (from 2001
study), C (from 2008 study), and D (from 2009 study) for
results of the interlaboratory studies supporting
acceptance of t he method.
A. Principle
In the Visual Immunoprecipitate (VIP) assay, proprietary
antibodies, with high specificity to antigens of Listeria
monocytogenes and related Listeria species, are bound
to a chromogenic carrier and separately to a solid
support matrix. These reagents are configured in a
single-use device that will produce a visually determined
reaction in the presence of Listeria. During the initial
hydration of the device, Listeria will react with an
antibody-chromogen complex contained in the device.
Antigen-antibody-chromogen complex is formed, which
flows across the lateral flow membrane and is
subsequently bound by antibody immobilized on
membrane. If Listeria is present in the test portion, a
detection line will form which is positioned across the
solid support in a viewing zone of the device. The
formation of a visually detectable line indicates a
positive reaction. Additionally, a procedural control zone
exists wherein a second line is formed indicating proper
test completion. Absence of a procedural control line
indicates an invalid test.
Método oficial AOAC 997.
Listeria monocytogenes y especies relacionadas de
Listeria en alimentos seleccionados y de superficies
ambientales
Ensayo de inmunoprecipitado visual (VIP)
(Aplicable a la detección de Listeria monocytogenes y
especies de Listeria relacionadas en productos lácteos,
carnes rojas, cerdo, aves y productos avícolas, mariscos,
frutas, verduras, nueces, pasta, chocolate, huevos y
harina de huesos, y superficies ambientales).
Precaución: las infecciones por Listeria monocytogenes
pueden causar la muerte fetal. Las mujeres
embarazadas, los ancianos y las personas
potencialmente inmunodeprimidas deben tener
prohibida la entrada a las salas de laboratorio o áreas
donde se estén realizando procedimientos de
enriquecimiento, aislamiento e identificación de L.
monocytogenes. Descontamine todos los medios y
equipos usados en la prueba antes de desechar los
medios o reutilizar el equipo.
Consulte las Tablas 997.03A (del estudio de 1997), B (del
estudio de 2001), C (del estudio de 2008) y D (del
estudio de 2009) para ver los resultados de los estudios
entre laboratorios que respaldan la aceptación del
método.
A. Principio
En el ensayo de inmunoprecipitado visual (VIP), los
anticuerpos patentados, con alta especificidad para los
antígenos de Listeria monocytogenes y especies de
Listeria relacionadas, se unen a un portador
cromogénico y por separado a una matriz de soporte
sólido. Estos reactivos están configurados en un
dispositivo de un solo uso que producirá una reacción
visual determinada en presencia de Listeria. Durante la
hidratación inicial del dispositivo, Listeria reaccionará
con un complejo de anticuerpo-cromógeno contenido
en el dispositivo. Se forma el complejo antígeno-
anticuerpo-cromógeno, que fluye a través de la
membrana de flujo lateral y posteriormente se une
mediante un anticuerpo inmovilizado en la membrana.
Si Listeria está presente en la porción de prueba, se
formará una línea de detección que se colocará a través
del soporte sólido en una zona de visualización del
dispositivo. La formación de una línea detectable
visualmente indica una reacción positiva. Además, existe
una zona de control de procedimiento en la que se
forma una segunda línea que indica la finalización
adecuada de la prueba. La ausencia de una línea de
control de procedimiento indica una prueba no válida.
 B. Apparatus
(a) Analytical balance. - For weighing test portions.
Measuring up to 1000 g, readability of ±0.2g.
(b) Vortex mixer. - For mixing contents of tubes.
(c) Syringe. - With 0.2 um or smaller porosity filter.
(d) Stomacher-Masticator or equivalent for
homogenizing test portions.
(e) Stomacher bags. - Bags with mesh filter or
equivalent.
(f) Incubator. - Maintaining 29-31°C.
(g) Water bath. - Maintaining 95-105°C. Alternatively,
flowing steam autoclave or dry heat block may be used.
(h) Micropipettors. - Accurately dispensing 0.1 and 1.0
mL volumes.
(i) Pipettor. - Accurately dispensing 2.0 mL volume.
C. Media and Reagents
Note: For all media and reagents, "water" refers to the
use of deionized water. Distilled water may also be used.
(a) VIP unit. - One per test (available as VIP Gold for
Listeria from BioControl Systems, Inc., Bellevue, WA,
USA; www. biocontrolsys.com).
(b) Modified Fraser Broth with lithium chloride (mFB +
LiCl).-Suspend 55 g commercial Fraser Broth (FB) base
into 1 L water. Mix thoroughly until completely
dissolved. Add 4 g lithium chloride (LiCl) and stir until
completely dissolved. Autoclave at 121°C for 15 min. Do
not overheat. Do not add ferric ammonium citrate
additive to broth. Do not use broth if precipitate forms.
Alternatively, prepare a 45% (w/v) LiCI solution by
dissolving 45 g LiCI in enough deionized water to make a
final volume of 100 mL. Filter-sterilize through a 0.2 um
filter. Add 2 mL sterile LiCI solution to 225 mL sterilized
FB. If using commercially prepared 8 M LiCI solution, add
2.65 mL per 225 mL sterilized FB.
(c) Buffered Listeria Enrichment Broth (BLEB). - Suspend
36.1 g commercial Listeria Enrichment Broth in 1 L
water. Add 8.5 g 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid
(MOPS) and 13.7 g MOPS-Na salt. Mix well and heat to
dissolve if necessary. Sterilize by autoclaving at 121°C for
15 min.
B. Aparato
(a) Balanza analítica. - Para pesar porciones de
prueba. Mide hasta 1000 g, legibilidad de ± 0,2 g.
(b) Mezclador de vórtice. - Para mezclar el contenido
de los tubos.
(c) Jeringa. - Con filtro de porosidad de 0,2 um o
menor.
(d) Stomacher-Masticator o equivalente para
homogeneizar las porciones de ensayo.
(e) Bolsas Stomacher. - Bolsas con filtro de malla o
equivalente.
(f) Incubadora. - Manteniendo 29-31 ° C.
(g) Baño de agua. - Manteniendo 95-105 ° C.
Alternativamente, se puede utilizar un autoclave de
vapor fluido o un bloque de calor seco.
(h) Micropipetas. - Dispensación precisa de
volúmenes de 0,1 y 1,0 ml.
(i) Pipeta. - Dispensación precisa de 2,0 ml de
volumen.
C. Medios y reactivos
Nota: Para todos los medios y reactivos, "agua" se
refiere al uso de agua desionizada. También se
puede utilizar agua destilada.
(a) Unidad VIP. - Una por prueba (disponible como
VIP Gold para Listeria de BioControl Systems, Inc.,
Bellevue, WA, EUA; www.biocontrolsys.com).
(b) Caldo Fraser modificado con cloruro de litio (mFB
+ LiCl) .- Suspenda 55 g de base de Caldo Fraser (FB)
comercial en 1 L de agua. Mezclar bien hasta que
esté completamente disuelto. Agregue 4 g de
cloruro de litio (LiCl) y revuelva hasta que esté
completamente disuelto. Esterilice en autoclave a
121 ° C durante 15 min. No sobrecalentar. No
agregue aditivo de citrato de amonio férrico al caldo.
No use caldo si se forma un precipitado.
Alternativamente, prepare una solución de LiCI al
45% (p / v) disolviendo 45 g de LiCI en suficiente
agua desionizada para hacer un volumen final de
100 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro
de 0,2 um. Agregue 2 ml de solución LiCI estéril a
225 ml de FB esterilizado. Si utiliza una solución de
LiCI 8 M preparada comercialmente, agregue 2,65
ml por 225 ml de FB esterilizado.
(c) Caldo de enriquecimiento de Listeria tamponado
(BLEB). - Suspenda 36,1 g de caldo de
enriquecimiento comercial para Listeria en 1 L de
agua. Añadir 8,5 g de ácido 3- (N-morfolino)
propanosulfónico (MOPS) y 13,7 g de sal MOPS-Na.
Mezclar bien y calentar para disolver si es necesario.
Esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 15 min.
 D. General Instructions
Store VIP units in foil pouch with desiccant at room
temperature (15-25°C). Do not refrigerate devices.
Do not use test devices if the indicator line on the
included desiccant pack is not blue. Do not use after
expiration date.
Do not reuse VIP units. After use, dispose units into
appropriate decontamination container and sterilize by
autoclaving used VIP units 15 min at 121°C prior to
discarding.
Perform positive and negative control cultures to
become familiar with interpretation of results.
E. Preparation of test portions
(a) Primary enrichment. - (1) Food products. - Add 25 g
test portion to 225 mL mFB+LiCl, C(b). Blend or stomach
solid food to homogenize test portion. (2)
Environmental monitoring. - For environmental sponges,
ensure that the sponge is in a horizontal position in the
bag and add 60 ml mFB+LiCI to sponge bag. If using a
swab, add inoculated swab to 10 mL mFB-LiCI. Mix well
with a stomacher or vortex mixer. Incubate 26-30 h at
29-31°C.
(b) Secondary enrichment. - Mix enriched broth. Transfer
1 mL incubated mFB+LiCI to 9 ml BLEB, C(c). Mix tubes in
vortex mixer and incubate at 29-31°C for 22-26 h.
(c) Inactivation. - Mix incubated BLEB tubes in vortex
mixer and transfer 1.0 mL to a clean tube. Inactivate the
test portion at 95-105°C for 5 min in a water bath,
autoclave, or dry heater. Cool tube to 25-37°C before
testing. Inactivated tubes can be stored at 2-8°C up to 4
days prior to testing. Store remaining BLEB post
enrichment tubes at 2-8°C for confirmation of
presumptive positives.
D. Instrucciones generales
Almacene las unidades VIP en una bolsa de aluminio con
desecante a temperatura ambiente (15-25 ° C). No
refrigere los dispositivos.
No use dispositivos de prueba si la línea indicadora del
paquete desecante incluido no es azul. No los use
después de la fecha de vencimiento.
No reutilice las unidades VIP. Después de su uso,
deseche las unidades en un recipiente de
descontaminación apropiado y esterilice en autoclave
las unidades VIP usadas durante 15 minutos a 121 ° C
antes de desecharlas.
Realice cultivos de control positivo y negativo para
familiarizarse con la interpretación de los resultados.
E. Preparación de porciones de prueba
(a) Enriquecimiento primario. - (1) Productos
alimenticios. - Añada 25 g de muestra de ensayo a 225
ml de mFB + LiCl, C (b). Mezclar o digerir alimentos
sólidos para homogeneizar la porción de prueba. (2)
Monitoreo ambiental. - Para esponjas ambientales,
asegúrese de que la esponja esté en posición horizontal
en la bolsa y agregue 60 ml de mFB + LiCI a la bolsa de
esponja. Si usa un hisopo, agregue el hisopo inoculado a
10 ml de mFB-LiCI. Mezclar bien con un mezclador
stomacher o vortex. Incubar 26-30 ha 29-31 ° C.
(b) Enriquecimiento secundario. - Mezclar caldo
enriquecido. Transfiera 1 ml de mFB + LiCI incubados a 9
ml de BLEB, C (c). Mezclar los tubos en un mezclador
vórtex e incubar a 29-31 ° C durante 22-26 h.
(c) Inactivación. - Mezcle los tubos BLEB incubados en un
mezclador vórtex y transfiera 1,0 ml a un tubo limpio.
Inactive la muestra de prueba a 95-105 ° C durante 5
min en un baño de agua, autoclave o calentador seco.
Enfríe el tubo a 25-37 ° C antes de realizar la prueba. Los
tubos inactivados se pueden almacenar a 2-8 ° C hasta 4
días antes de la prueba. Almacene los tubos de
posenriquecimiento BLEB restantes a 2-8 ° C para la
confirmación de presuntos positivos.
 F. VIP Assay Procedure
Open sealed pouch containing VIP units, C(a), and
remove required number of tests. Use one device per
test portion. VIP units may not be re-used. Reseal
unused VIP units in pouch containing desiccant. Store
pouch at room temperature (15-25°C).
Equilibrate inactivated broths to 25-37°C prior to assay
Mix contents in a vortex mixer. Transfer 0.1 mL
inactivated test suspension to sample addition well.
Transfer only liquid, not food particulates, to the device.
Incubate device at room temperature (15-25°C) for 10
min. Proceed directly to G.
G. Reading and Interpreting Results
Note: Examine device immediately after 10 min
incubation. Otherwise, faint lines may develop because
of nonspecific color development that should be
disregarded.
Examine VIP unit for the presence of distinct detection
lines in both test sample and test verification zones.
Lines should be dark when contrasted with white
background and should extend across the zones.
Intensity of test sample and test verification lines may
differ. Test is valid if a line is present in test verification
zone. If no control line is present in the test verification
zone, the test is invalid.
H. Confirmation of Positive VIP Samples
Presumptive positive tests must be confirmed, isolating
from retained refrigerated post enrichment broths, E(c),
using culture methods as described in the current
edition of Bacteriological Analytical Manual, U.S. Food
and Drug Administration/Center for Food Safety and
Applied Nutrition, College Park, MD, USA, or
Microbiology Laboratory Guidebook, U.S. Department of
Agriculture/Food Safety and Inspection Service,
Washington, DC, USA
(http://www.fsis.usda.gov/Science/Microbiological Lab
Guidebook/index.asp).
References: J. AOẠC Int. 80, 791(1997); 85, 470(2002);
91, 365(2008); 92, 1421(2009)
F. Procedimiento de ensayo VIP
Abra la bolsa sellada que contiene las unidades VIP, C
(a), y retire el número requerido de pruebas. Utilice un
dispositivo por porción de prueba. Las unidades VIP no
se pueden reutilizar. Vuelva a sellar las unidades VIP no
utilizadas en una bolsa que contiene desecante. Guarde
la bolsa a temperatura ambiente (15-25 ° C).
Equilibre los caldos inactivados a 25-37 ° C antes del
ensayo.
Mezcle el contenido en un mezclador vórtex. Transfiera
0,1 ml de suspensión de prueba inactivada al pocillo de
adición de muestra. Transfiera solo líquido, no partículas
de alimentos, al dispositivo. Incube el dispositivo a
temperatura ambiente (15-25 ° C) durante 10 min.
Proceda directamente a G.
G. Lectura e interpretación de resultados
Nota: Examine el dispositivo inmediatamente después
de 10 min de incubación. De lo contrario, se pueden
desarrollar líneas tenues debido a un desarrollo de color
inespecífico que debe ignorarse.
Examine la unidad VIP para detectar la presencia de
líneas de detección distintas tanto en la muestra de
prueba como en las zonas de verificación de prueba. Las
líneas deben ser oscuras cuando se contrastan con el
fondo blanco y deben extenderse a lo largo de las zonas.
La intensidad de la muestra de prueba y las líneas de
verificación de prueba pueden diferir. La prueba es
válida si hay una línea presente en la zona de
verificación de prueba. Si no hay una línea de control
presente en la zona de verificación de la prueba, la
prueba no es válida.
H. Confirmación de muestras VIP positivas
Las pruebas presuntivas positivas deben ser
confirmadas, aislándose de los caldos refrigerados
posteriores al enriquecimiento retenidos, E (c),
utilizando métodos de cultivo como se describe en la
edición actual del Manual analítico bacteriológico,
Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. /
Centro para la Seguridad Alimentaria y la Nutrición
Aplicada, College Park , MD, EE. UU., O la Guía del
laboratorio de microbiología, Departamento de
Agricultura de EE. UU. / Servicio de inspección y
seguridad alimentaria, Washington, DC, EE. UU.
(http://www.fsis.usda.gov/Science/Microbiological Lab
Guidebook/index.asp).
References: J. AOẠC Int. 80, 791(1997); 85, 470(2002);
91, 365(2008); 92, 1421(2009)