Asignatura: Microbiología Aplicada

Unidad Curricular: I

Practica Nº2: Recuentos de microorganismos aerobios, mohos y levaduras en productos de uso y

consumo humano

1. Objetivo General

• Determinar del recuento total de microorganismos aerobios, mohos y levaduras de los

diferentes tipos de productos no estériles mediante los métodos de recuento: vertido en
placa y filtración por membrana.

2. Objetivos específicos

• Determinar el número de microorganismos presentes en productos de diferentes rutas de

administración por medio de la técnica de recuento en placa por el método de vertido.

• Determinar el número de microorganismos presentes en productos de diferentes rutas de

administración por de la técnica de recuento en placa por el método de filtración por
membrana.

• Comparar los resultados obtenidos con los publicados en la Farmacopea y determinar si el

producto cumple o no con los criterios de aceptación según la forma farmacéutica.

3. Fundamento Teórico

Una forma farmacéutica no estéril se define como una matriz que contiene una cantidad limitada
de carga microbiana y no porta microorganismos patógenos para el ser humano, para ser
considerada como segura. Los productos no estériles son propensos a contaminarse durante el
proceso de fabricación: pesado, llenado, almacenamiento, distribución y durante su uso diario. Sin
embargo, no deben exceder los límites establecidos

Dentro del capítulo ˂61˃ especificado en la UPS41 se abarcan especificaciones a desarrollar y

aplicar para evaluar la calidad microbiológica de los productos farmacéuticos no estériles, el
capítulo, EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS NO ESTÉRILES: PRUEBAS DE RECUENTO
MICROBIANO, las pruebas que se describen permitirán el recuento cuantitativo de bacterias
mesófilas y hongos que pueden desarrollarse en condiciones aerobias.

Los métodos de recuento microbiano de productos no estériles son: filtración por membrana,
recuento en placa (extensión y vertido) y el Número más probable (NMP) siendo este último el
método menos exacto, pero sin embargo puede ser aplicado a productos con biocarga muy baja.
(USP 41). En esta práctica se utilizará el recuento en placa o filtración por membrana para el
análisis de un producto sólido para calcular tanto el recuento total de microorganismos aerobios
(RTMA) como el recuento total de mohos y levaduras (RTML).

Para saber si este método es apto para el recuento de microorganismos en el producto, primero
debe determinarse la aptitud de este método, debido a que los principios activos, los excipientes o
los factores intrínsecos de la formulación, podrían inhibir el crecimiento de los microorganismos
que pudieran estar presentes en la forma farmacéutica o de aquellos que pudieran contaminarla
posteriormente.

El contaje máximo de microorganismos aerobios y mohos y levaduras depende de la forma

farmacéutica como se indica a continuación:

Tabla 1. Criterios de aceptación microbiológica para productos de tipo no estériles

Tomado de la USP 41
Cuando se indica un criterio de aceptación para la calidad microbiológica, interpretar de la
siguiente manera:

101 ufc: recuento máximo aceptable=20

102 ufc: recuento máximo aceptable=200

103 ufc: recuento máximo aceptable=2000

Para aplicar los diferentes métodos de recuento es necesario neutralizar los agentes
antimicrobianos que presenta el producto para poder realizar el conteo de los microorganismos
presentes, dentro de los métodos de neutralización son:

• Diluciones

• Filtración por membrana

• Incorporación de agentes neutralizantes. Ejemplos de agentes neutralizantes Tabla 2.

• Una combinación de todas las medidas anteriores

Tabla 2. Agentes Neutralizantes

Sustancias de Interferencia Agentes Neutralizantes Potenciales

Glutaraldehído, mercuriales Sulfito acido de sodio

Fenólicos, alcohol, aldehídos, sorbato Dilución

Aldehídos Glicina

Compuestos de amonio cuaternario (CAC), Lecitina

parahidroxibenzoatos (parabenos), bis-biguanidas

CAC, yodo, parabenos Polisorbato

Mercuriales Tioglicolato

Mercuriales, halógenos, aldehído Tiosulfato

EDTA Iones de Mg o Ca

Nota: Adaptado de la Farmacopea de los Estados Unidos por Naranjo M. (2023)

4. Parte Experimental

1. Equipos, medios de cultivo y materiales

• Equipos
EQUIPOS

Incubadora para hongos y bacterias

Mechero

Micropipetas

Baño María

Equipo de filtración

Equipo de protección personal (Mascarilla, guantes, cofia y

mandil)

• Materiales y Medios de Cultivo

Medios/materiales Indicaciones Uso

Solución Salina + Tween 20 9.9ml Preparar inóculo prueba aptitud

Diluciones del producto (excepto

TSB 9ml
crema)

TSA Una para RTMA Siembra membrana

SAB Una para RTML Siembra membrana

Agua destilada Estéril Lavados de membrana

Caldo caseína lecitina 9ml Diluciones de crema

Jarabe

Muestra Comprimidos

Crema

Membranas

Pinzas

Matraces Material Estéril

Kitasato

compresor

• Microorganismo
CEPAS MICROBIANAS

Staphylococcus aureus ATCC 25923

• Reactivos

Reactivos

Alcohol antiséptico 70º

2. Procedimiento

PARTE I: Ejemplo de la Aptitud del método de recuento en presencia del producto, aplicado en la
crema de urea

• Disolver 1g del producto a examinar en un tubo con 9 ml de de caldo peptona de caseína-

lecitina con tween 20 (dilución 1:10). Preparar una dilución 1:100.

• Preparar el inoculo de Staphylococcus aureus en solución salina + tween 20 a una

concentración de aproximadamente 100 UFC/mL.

• Para la aptitud del método se debe tener tres grupos:

Grupo A: Es el inoculo en solución salina que contiene aproximadamente las 100 UCF/mL, de este
grupo tomar un 1mL y sembrar por vertido en el medio TSA.

Grupo B: Es el inoculo más el diluyente (caldo peptona de caseína-lecitina + tween), tomar 1mL del
inoculo de las 100 UFC y llevar a un tubo que contenga 10 mL del diluyente. Sembrar 1mL del
grupo B por vertido en TSA.

Grupo C: Es el inoculo más el producto disuelto en el diluyente. Sembrar 1mL del grupo por vertido
en TSA.

• Incubar las cajas de los tres grupos de 30 a 35ºC por un tiempo de 24 a 48 horas y dar
lectura a las mismas.

Nota: Para validar el método se debe comparar los tres grupos y se esperar recuperar
aproximadamente las 100 UFC en los tres grupos.
PARTE II: Prueba de recuento en producto sólido oral, por el método de vertido en placa

• Triturar los comprimidos en un mortero previamente esterilizado, hasta obtener una masa
de un gramo, disolver 1g del producto a examinar en un tubo con 9 ml de TSB y
homogenizar vigorosamente. Dependiendo del producto puede ser necesario hacer más
diluciones.

• Para el RTMA: Tomar 1mL de la muestra tratada y sembrar por vertido en placas con TSA,
realizar el procedimiento por duplicado.

• Para el RTML: Tomar 1mL de la muestra tratada y sembrar por vertido en placas con SAB,
realizar el procedimiento por duplicado.

• Incubar a 30° a 35°C durante 24 a 48 horas para bacterias y 25°C durante 5 días para
hongos y levaduras.

• Contar las colonias en cada caja y sacar el promedio. Las cajas son válidas para contaje si
tienen entre 30-300 colonias en TSA, de 30-300 levaduras en SAB y de 8-80 para mohos en
SAB.

• Calcular en número de UFC/g de producto.

• Comparar los resultados con lo establecido en la Farmacopea y concluir.

PARTE III: Prueba de recuento en producto, crema de urea, por el método de vertido en placa

• Pesar 1g del producto a examinar y disolver en un tubo que contenga 9 ml de caldo

peptona de caseína-lecitina polisorbato y homogenizar vigorosamente. Después realizar
una segunda dilución en el mismo caldo de caseína.

• Para el RTMA: Tomar 1mL de la primera dilución de la muestra tratada y sembrar por
vertido en placas con TSA, realizar el procedimiento por duplicado.

• Para el RTML: Tomar 1mL de la primera dilución muestra tratada y sembrar por vertido en
placas con SAB, realizar el procedimiento por duplicado.

• Incubar a 30° a 35°C durante 24 a 48 horas para bacterias y 25°C durante 5 días para
hongos y levaduras.

• Contar las colonias en cada caja y sacar el promedio. Las cajas son válidas para contaje si
tienen entre 30-300 colonias en TSA, de 30-300 levaduras en SAB y de 8-80 para mohos en
SAB.

• Calcular en número de UFC/g de producto.

• Comparar los resultados con lo establecido en la Farmacopea y concluir.

NOTA:

• En el método de vertido en placa, una dilución de 1:10 significa que se pipetearon 0,1 g/ml
del producto en la placa de Petri vacía antes de verter el medio. Esto significa que,
 considerando los criterios de aceptación basados en 1 g, al menos 10 microorganismos
deberían estar presentes en el ml de la dilución 1:10 para que al menos 1 colonia sea
detectada. Por tanto, el límite de detección es de 10 UFC/g.

• Si durante las pruebas de rutina no hay colonias presentes en los medios nutritivos, el
resultado final no es 0 UFC/g sino menos de 10 UFC/g para tener en cuenta este límite de
detección.

• En el método de filtración por membrana si se filtra 1g del producto, el resultado sin

crecimiento es inferior a 1 UFC/g.

PARTE IV. Prueba de recuento en producto, jarabe, por el método de Filtración por membrana.

• Disolver 1ml del producto a examinar en un tubo con 9 ml de TSB.

• Añadir 1% de polisorbato 80 para neutralizar la actividad antimicrobiana. Mezclar y luego

dejar en reposo 5 minutos.

• Usando pinzas estériles colocar una membrana filtrante estéril con un tamaño nominal de
poro no mayor de 0,45 μm, sobre el centro del porta filtros, con la superficie cuadriculada
hacia arriba.

• Ensamblar y asegurar el equipo de filtración (vaso de filtración, matraz Kitasato,

mangueras y bomba de vacío).

• Filtrar inmediatamente y enjuagar el filtro de membrana con 25 ml de agua destilada

estéril.

• Remover el vaso de filtración, y con una pinza estéril transferir la membrana (con la
cuadrícula hacia arriba), a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo
correspondiente:

• Para determinar el recuento total de microorganismos aerobios (RTMA), transferir el filtro

de membrana a la superficie de una caja de TSA.

• Para determinar el recuento total de levaduras (RTML), transferir la membrana a la

superficie de una caja de Agar Sabouraud Dextrosa.

• Al colocar la membrana, evitar la formación de burbujas entre ésta y el medio de cultivo.

• Esperar 20 minutos para permitir la adhesión de la membrana al medio.

• Incubar a 30° a 35°C durante 24 a 48 horas para bacterias y 25°C durante 5 días para
hongos y levaduras.

• Contar las colonias en caso de haber crecimiento.

• Las cajas son válidas para contaje si tienen entre 20-80 colonias en TSA,

3. Manejo de residuos, Tratamiento y etiquetado

Eliminar correctamente los desechos generados:

Todo material que haya tenido contacto con las bacterias depositarlo en el tacho de basura con la
funda roja. (guantes, mascarilla, toca, papel absorbente).

Material cortopunzante como: palillos e hisopos deben ser depositados en el contenedor de

cortopunzantes.

4. Lecturas adicionales sugeridas

5. Resultados

• Identificación de la muestra:

Forma Farmacéutica

Nombre del medicamento

Principio activo

Lote

Fecha de elaboración

Fecha de caducidad

• Aptitud del método de Recuento en placa por vertido:

Método de vertido

Grupo A Grupo B Grupo C

Forma farmacéutica Microorganismo de
UFC/ml UFC/ml UFC/ml
prueba

• Recuento total de microorganismos en producto sólido oral (prueba en producto)

 Método de vertido

Dilución de la Recuento
Medio de muestra Factor de dilución
promedio de
cultivo de la muestra
las cajas

• Realizar aquí los cálculos y reportar RTMA en UFC/g y RTML en UFC/g

• Recuento total de microorganismos en producto jarabe (prueba en producto)

Método de filtración por membrana

Dilución de la Recuento promedio

Medio de muestra Volumen de las cajas Factor de dilución
cultivo filtrado de la muestra (FD)

• Realizar aquí los cálculos y reportar RTMA en UFC/mL y RTML en UFC/mL

UFC/ml=No. Colonias_____ x FD
 vol filtrado en ml

• Recuento total de microorganismos en producto crema (prueba en producto)

Método de vertido

Dilución de la
muestra Recuento
Factor de dilución de la
Medio de cultivo promedio de las
muestra
cajas

• Realizar aquí los cálculos y reportar RTMA en UFC/g y RTML en UFC/g

5. Cuestionario

• ¿El producto cumple o no con los criterios de aceptación establecidos en la Farmacopea?

Ver Anexo 1.

• Proponga cuáles serían DOS razones por las que el RTMA y el RTML aumentará en los
productos.

• ¿Por qué la membrana filtrante debe tener un tamaño nominal de poro no mayor de 0,45
μm?

6. Bibliografía

• USP. (2018). United States pharmacopeia 36-The national formulary 41. Rockville, MD:
United Book Press. Volumen 4. Capitulo 61